腓骨杯樁菇基本營養成分和揮發性物質分析及評價

何軼榕，王術榮*，孟俊龍，常明昌

（1.山西農業大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030800；2.黃土高原食用菌提質增效協同創新中心，山西 太谷 030800）

五臺山地貌多樣、氣候清涼、臺蘑資源豐富。臺蘑包括大白樁菇、肉色杯傘、落葉杯傘、紫丁香蘑、堊白樁菇等，俗名有白銀盤、紅銀盤、水皮子、小香蕈、大香蕈、虎皮臺蘑等[1]。史光中等[2]研究了大白樁菇（白銀盤）、肉色杯傘（紅銀盤）、紫丁香蘑（大香蕈）和堊白樁菇（小香蕈）等野生臺蘑的營養成分，發現野生臺蘑的營養價值很高，蛋白質含量大約占干物質的40%。羅明正等[3]全面分析評價了五臺山大白樁菇（白銀盤）、肉色杯傘（紅銀盤）、堊白樁菇（小香蕈）和紫丁香蘑（大香蕈）中蛋白質的營養價值，發現這4種野生臺蘑中，肉色杯傘的蛋白質含量最高，其次是大白樁菇，紫丁香菇和堊白樁菇最低，但都比茶樹菇和香菇的蛋白質營養價值要高。張芳雅等[4]對落葉杯傘（水皮子）的化學成分進行了研究，通過提取、分離及鑒定，從落葉杯傘（水皮子）中共得到10個單體化合物。本文對腓骨杯樁菇（Clitopaxillus fibulatus）的基本營養成分、氨基酸組成和揮發性物質進行測定分析，以期為腓骨杯樁菇的產品開發和深層次利用提供重要參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腓骨杯樁菇（虎皮臺蘑）于2019年8月18日采自山西省五臺山自然保護區，編號G16174。將采回的新鮮子實體于65℃烘干箱中烘干，研磨機磨粉，過80目篩，裝入塑封袋，4℃冰箱保存。

DNA試劑盒：美國OMEGA公司；瓊脂：上海生物工程有限公司；HCl（分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

Eclipse Ni-U光學顯微鏡：日本尼康公司；TB-214型電子分析天平：北京賽得利斯儀器系統有限公司；GZX-9240MBE型電恒溫鼓風干燥箱：上海博訊實業有限責任公司；MultifugeX1R Centrifuge離心機：美國THERMO公司；KDN-1型全自動凱氏定氮儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；Biochrom-30+全自動氨基酸分析儀：英國百康biochrom公司；StableFlex手動固相微萃取裝置：美國Supelco公司；HP6890/5975C型氣相色譜質譜聯用儀：美國Agilent公司；Gel DOCTMXR+凝膠成像分析、C1000 TouchTM溫度梯度基因擴增儀（polymerase chain reaction，PCR）：美國BIO RAD公司。

1.3 形態學分析

觀察新鮮子實體的宏觀形態并且拍照記錄，于55℃烘干箱中烘干，制作標本，標本收藏于山西農業大學菌物標本館（HMSAU）。將干標本徒手切片，在5%KOH溶液中復水，采用光學顯微鏡對復水后的切片觀測其孢子、擔子等顯微結構[5]。

1.4 分子生物學鑒定

分子生物學鑒定步驟包括DNA提取、PCR擴增和測序。從干燥的真菌標本中提取基因組DNA，提取后測定DNA的濃度。PCR擴增遵循Vilgalys和Hester協議[6]進行擴增反應，在擴增反應中使用引物ITS8-F/LR3，對DNA的內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）和核糖體大亞基區（ribosomal large subunit，LSU）進行擴增。將得到的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 基本營養成分分析

蛋白質含量測定方法參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[7]；脂肪含量測定參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》[8]；灰分含量測定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》[9]；總糖的測定采用徐顯利等[10]的方法進行測定；多糖含量采用苯酚-硫酸法進行檢測[11]。根據上述方法依次對腓骨杯樁菇的蛋白質、脂肪、灰分、總糖和多糖進行含量測定。

1.6 腓骨杯樁菇子實體的氨基酸檢測及分析

使用分析天平稱量子實體粉0.2 g，置于安瓿管中加6 mol/L HCl溶液定容至10 mL。通入氮氣迅速封口后，置于110℃烘箱內水解22 h，將安瓿管取出后迅速冰水浴冷卻至室溫（25℃）。然后，將樣品水解液經濾紙過濾后，用0.01 mol/L HCl定容至50 mL，準確吸取水解液2.0 mL，置于60℃下真空旋轉蒸干；繼續加入0.02 mol/L HCl溶液 2.0 mL，過 0.45 μm 濾膜，即得酸水解液。取20 μL水解液樣品到氨基酸自動分析儀，分析樣品蛋白中水解氨基酸的組成與比例含量；最后，根據氨基酸平衡理論世界衛生組織/聯合國糧農組織（World Health Organization/Food&Agriculture Organization，WHO/FAO）的必需氨基酸模式，采用氨基酸的化學評分（amino acid score，AAS）來評價腓骨杯樁菇子實體的營養價值[12-13]。

1.7 腓骨杯樁菇子實體的揮發性物質檢測及分析

1.7.1 固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）進樣條件

準確稱取烘干的腓骨杯樁菇子實體粉1.0 g，將其裝入10 mL固相微萃取的樣品瓶，放置于60℃恒溫水浴搖床振蕩30 min，取樣前將萃取頭放置在250℃的氣相色譜進樣口，老化30 min的萃取頭并進行空白試驗，直至無雜峰出現。然后，將SPME萃取頭迅速插入樣品瓶的頂空部分，在60℃下萃取吸附30 min后，抽回萃取頭，再迅速插入氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）進樣口，置于 250 ℃下解吸5 min后，進行GC-MS分析測定樣品中揮發性風味物質。

1.7.2 氣相色譜-質譜分析條件

氣相色譜條件：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性毛細管柱；進樣口溫度250℃；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，不分流進樣模式，隨后進行程序升溫；柱溫起始溫度35℃，停留3min，以5℃/min升至180℃，保持3min，然后再以10℃/min升至250℃，最后停留5 min。

質譜條件：電子轟擊（electron ionization，EI）離子源，溫度250℃，電子能量70 eV，傳輸線溫度250℃，離子源四極桿溫度150℃，質量掃描范圍35 m/z～500 m/z，分析化合物CAS號經NIST和WLIEYT譜圖庫檢索分析確認定性[14-15]。

1.7.3 揮發性物質檢測數據分析

數據經過檢索對比后選擇匹配度大于800的結果進行確認，經計算機檢索結合譜庫確定其揮發性物質并用峰面積歸一化法確定揮發性物質的相對含量，通過保留時間、質譜及化合物成分等參數進一步確定其揮發性物質[16-17]。

1.8 數據處理

采用Excel統計所有數據，并采用Origin軟件進行繪圖，所有試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 形態學分析

腓骨杯樁菇的子實體形態見圖1。

圖1 腓骨杯樁菇的子實體Fig.1 Basidiomata of Clitopaxillus fibulatus

初期菌蓋凸起，隨著年齡的增長漸漸平展，中間略微凹陷，乳白色至淺褐色，邊緣內卷，菌蓋寬4 cm～10cm，具有同心皺紋或裂縫；菌褶彎生至延生，奶油色至淡黃色，有分叉，褶間有橫脈；菌柄（4～10）cm×（1～3）cm，實心，圓柱形，黃白色至淡黃色，菌柄內部隨著年齡的增長逐漸變成海綿狀；菌肉氣味濃厚。

擔孢子（5.12～6.45）μm×（3.93～4.57）μm（n=20），（長寬比，Q）=1.30～1.41，（長寬比平均值，Qm）=1.36±0.10，寬橢圓形至橢圓形，壁薄光滑，無色透明。擔子（23.5～37.6）μm×（4.8～6.4）μm（n=20），長棍棒狀到接近圓柱形，有4個擔子小梗，小梗長約5 μm。褶緣囊狀體（30.34～9.67）μm×（7.46～8.12）μm。鎖狀聯合存在于子實體的菌絲和基部，有時候呈現環形或者未封閉狀態。菌絲細胞內帶有褐色色素。

2.2 分子學鑒定

基于腓骨杯樁菇的ITS序列構建的ML系統發育樹見圖2。

圖2 基于腓骨杯樁菇的ITS序列構建的ML系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Clitopaxillus fibulatus and rellated species based on ITS sequence

通過rDNA的ITS、序列比對和人工復檢后，將序列在NCBI數據庫中進行比對。并從構建的ML系統發育樹分析，以灰乳牛肝菌Suillus viscidus（MZ005510.1）做外類群比對，本研究采集的G16174標本與已有相關研究的腓骨杯樁菇（Clitopaxillus fibulatus）模式標本ITS序列聚在一起，支持率高達100%，并且與褶樁菇屬及近似屬的其他物種分開。

2.3 腓骨杯樁菇基本營養成分分析

腓骨杯樁菇的主要營養成分分析見表1。

表1 腓骨杯樁菇的主要營養成分分析Table 1 Analysis of main nurition components of Clitopaxillus fibulatus

子實體干品中含有33.9%的蛋白質、5.9%的灰分、1.6%的脂肪、45.3%的總糖和4.32%的多糖。腓骨杯樁菇蛋白質含量是平菇的1.8倍，是香菇的1.7倍（平菇的蛋白質含量為19.08%[19]，香菇的20.3%[20]），其脂肪含量是平菇的0.9倍，是香菇0.5倍（平菇的脂肪含量為1.71%[19]，香菇的脂肪含量為3.4%[20]）。綜上所述，腓骨杯樁菇的蛋白質含量較高，脂肪含量較低，營養價值豐富，是一種優質的植物蛋白的來源。

2.4 氨基酸組成分析及評價

2.4.1 氨基酸組成分析

腓骨杯樁菇氨基酸分析色譜圖見圖3。腓骨杯樁菇中氨基酸的組成與含量分析見表2。

圖3 腓骨杯樁菇氨基酸分析色譜圖Fig.3 Amino acid chromatograms of Clitopaxillus fibulatus

表2 腓骨杯樁菇中氨基酸的組成與含量分析Table 2 Composition and content analysis of Clitopaxillus fibulatus

腓骨杯樁菇經過酸水解后對其氨基酸種類及含量進行測定。測得的17種氨基酸（色氨酸除外）中，必需氨基酸有7種，非必需氨基酸有10種。必需氨基酸占總氨基酸含量的33.06%，必需氨基酸占非必需氨基酸含量的49.39%。在必需氨基酸中，賴氨酸的含量為33.53 mg/g，占必需氨基酸總含量的29.61%，可以補充人體賴氨酸的不足。腓骨杯樁菇子實體中含氮呈味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸）的總量為173.05 mg/g，占總氨基酸含量的47.09%。極其豐富的含氮呈味氨基酸，賦予腓骨杯樁菇良好的風味與鮮味，為開發天然呈鮮味物質及其功能性風味食品提供了理論依據[21-22]。

2.4.2 氨基酸評價

腓骨杯樁菇的氨基酸評價見表3。

表3 腓骨杯樁菇的氨基酸評價Table 3 Evaluation of amino acids of Clitopaxillus fibulatus

氨基酸評分主要反映的是食物蛋白中氨基酸含量與氨基酸評分模式中對應氨基酸需要量相比的滿足程度。由表3知，腓骨杯樁菇氨基酸含量能滿足FAO/WHO的成人推薦值[23-24]，其中賴氨酸高于成人模式推薦值的1.09倍，氨基酸評分高達2.10；蘇氨酸高于成人模式推薦值的1.21倍，氨基酸評分高達2.21；苯丙氨酸+酪氨酸高于成人模式推薦值的0.58倍，氨基酸評分為1.58。因此可得，腓骨杯樁菇能滿足成人對氨基酸的需求。

2.5 腓骨杯樁菇子實體揮發性物質分析

腓骨杯樁菇子實體中揮發性風味成分的GC-MS總離子流色譜圖見圖4。腓骨杯樁揮發性成分的GCMS鑒定結果見表4。

圖4 腓骨杯樁菇子實體中揮發性風味成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of GC-MS from volatile flavor components in Clitopaxillus fibulatus

表4 腓骨杯樁揮發性成分的GC-MS鑒定結果Table 4 Analytical results for GC-MS identification of volatile compounds in Clitopaxillus fibulatus

續表4 腓骨杯樁揮發性成分的GC-MS鑒定結果Continue table 4 Analytical results for GC-MS identification of volatile compounds in Clitopaxillus fibulatus

采用固相微萃取、氣相色譜-質譜的方法分析腓骨杯樁菇的揮發性物質[25]。共檢測出的58種化合物中醛、醇、酮、烷烴種類比較豐富，分別有12種、6種、7種、7種，其含量也比較高，分別占總揮發物質的31.08%、14.17%、7.42%、5.47%、6.43%。在醛類揮發物中，己醛的含量達到了15.05%，使子實體具有獨特的油脂和蘋果香氣。其他揮發物質：酸類物質5種、吡嗪2種、酯類2種、呋喃1種，分別占總揮發物質的5.47%、3.77%、3.35%、12.70%。豐富的揮發物質構成了腓骨杯樁菇獨特的風味，賦予其獨特鮮味物質[26]。綜上所述，這些主要的風味化合物與腓骨杯樁菇獨特的香味有密切的聯系。

3 結論

通過形態學和分子生物學分析驗證了此種臺蘑為腓骨杯樁菇，其子實體蛋白質、總糖、多糖含量比較高，分別占干樣的33.9%、45.3%、4.32%，灰分和脂肪含量比較低，分別占干樣的5.9%、1.6%。其蛋白質含量高于香菇和平菇，脂肪含量卻低于香菇和平菇。子實體中氨基酸種類齊全，共有17種氨基酸，其中必需氨基酸占總氨基酸含量的33.06%，必需氨基酸占非必需氨基酸的49.39%，能滿足FAO/WHO的18歲以上推薦值。含有的58種揮發物質中醛、醇、酮、烷烴種類比較多，醛類的揮發性物質含量高達31.08%，特別是己醛，達到了15.05%，賦予了子實體油脂和青草氣及蘋果香味，2-正戊基呋喃含量為12.70%，給予子實體獨特的鮮味。綜上所述，腓骨杯樁菇子實體是一種高蛋白、低脂、能滿足人體需求、具有獨特風味的食品原料，可進一步深層次開發臺蘑風味食品和產品。