桑黃提取物的制備工藝及凍干粉抗氧化、抑菌活性的研究

龔蘭敏，劉剛*，白杰，劉德龍，何揚航

（1.四川師范大學生命科學學院,食品功能及加工應用研究所，四川 成都 610101；2.成都市益康堂藥業有限公司，四川 成都 610509）

桑黃（Phellinus igniarius）是一類大型的珍稀藥用真菌，屬于銹革孔菌科木層孔菌屬，主要寄生于闊葉樹樹種，常分布于中國、韓國和日本[1]，據《中藥大辭典》記載“桑黃可用于痢疾、閉經、瀉血、血崩、淋病等疾病的治療”，具有悠久的中醫應用歷史[2]，享有“森林黃金”美稱，功能多樣。桑黃富含生物活性成分，如糖類、萜類、黃酮類、氨基酸等，目前研究表明桑黃具有抗腫瘤[3]、降低血糖濃度、預防糖尿病[4]、提高免疫力[5]等作用，其中桑黃多糖和總三萜成分具有良好的抗氧化[6]、抗菌[7]、抗癌等作用[8-10]，具有較好的藥用價值和開發前景。

可食用酵素是以新鮮果蔬、谷物、中草藥等為原料，在多種有益菌的自然條件下發酵產出的含有豐富的有機酸、維生素、萜類物等功能成分的混合發酵液，可催化新陳代謝、養分和能量轉化等作用，但不會使其物質及生化反應造成改變，酵素具有解酒護肝、提高免疫力、抗氧化等功能[11]。

酵素起源于日本，在日本發展已經相當成熟，在歐洲、加拿大等地也開始盛行，而在中國仍處于低潮期[12]。目前關于桑黃液態產品的開發主是中藥發酵與藥酒生產，而通過添加酵素制備桑黃口服液是一種較新的思路。基于此，本試驗以桑黃為原材料，采用諾麗果酵素和木瓜酵素發酵，研究桑黃功效成分的最佳提取條件，測定不同提取條件下桑黃提取液核酸、總三萜、多糖等含量，研究其水提和醇提物的抗氧化和抑菌活性，使桑黃有效成分得到更好的開發利用，有望成為促進人類健康的新型功能性食品。

1 材料與方法

1.1 材料

桑黃、諾麗果酵素、木瓜酵素：成都益康堂公司；黃酒：浙江古越龍山紹興酒股份有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：四川師范大學生命科學學院實驗室。

1.2 試劑與儀器

乙酸乙酯、乙醇、高氯酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、香草醛、冰醋酸、無水葡萄糖（均為分析純）：成都市科隆化工試劑廠；硫酸（分析純）：四川西隴化工有限公司；三氯乙酸（分析純）、白樺酯醇標準品（HPLC≥98%）、蘆丁標準品（HPLC≥98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-nitro-henylhydrazine，DPPH）（純度 99%）：成都碩博研創公司；牛肉膏蛋白胨（LB）培養基：杭州微生物試劑有限公司。

FD-1A-50型冷凍干燥機：江蘇天翎儀器有限公司；DHP-9082型電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司生產；RE-52AA型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠制造；HKC-40A型超聲波儀：昆山市超聲儀器有限公司；BioMate 3S型紫外分光光度計：Thermo公司；JA5003型電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑黃提取液的制備

參考文獻[13]，進行桑黃功效成分的提取。稱取6份過100目篩的桑黃粉末500 g，分為兩組，料液比1∶6（g/mL）。一組樣品進行水提，一組樣品進行醇提（黃酒）。水提直接使用煎煮法進行桑黃成分的提取。醇提使用黃酒進行提取。

水提、乙醇提組內合并濾液各得1000mL，不同提取方式的桑黃濾液各取6個100 mL樣品，3個樣品中分別加入木瓜酵素30 mL、3個樣品中分別加入諾麗果酵素30mL（按照3kg桑黃，加入180 mL酵素計算），得4種配方桑黃提取液（計算提取液得率）[13]。

以抽真空的方式使樣品中水分直接升華，進而濃縮桑黃提取液，分別于冷凍干燥機進行凍干，稱量記錄（計算凍干粉得率）。計算提取液和凍干粉的得率公式如下。

1.3.2 桑黃提取液多糖含量的測定

桑黃提取液的多糖含量是其總糖含量與還原糖含量的差值，按下列方法測定總糖、還原糖的含量。

用硫酸-苯酚法[14-15]測定總糖的含量：準確稱取烘干后無水葡萄糖50 mg置于500 mL容量瓶，蒸餾水溶解、定容，搖勻。加蒸餾水配制成濃度梯度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的標準溶液。分別取不同濃度的標準溶液1 mL，各加5%的苯酚1 mL，并迅速加入5 mL濃H2SO4，25℃靜置10 min后搖勻，再放置30 min，于490 nm處測定OD值，作總糖標準曲線，曲線回歸方程為y=10.364x+0.089 4，R2=0.997 2，線性關系良好，可用于測定總糖含量，結果見圖1。

圖1 測定桑黃總糖、還原糖標準曲線Fig.1 Determination of the standard curve of P.igniarius total sugar and reducing sugar

用3，5-二硝基水楊酸法[16]測定還原糖的含量：準確稱取烘干后無水葡萄糖1 g于1 000 mL容量瓶，定容后搖勻。分別取1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于6支試管中，補蒸餾水至0.5 mL，分別加1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑，5 min沸水浴后立即用冷水冷卻，加蒸餾水至6 mL，混勻，在540 nm處測吸光度值，作還原糖標準曲線，回歸方程為 y=3.866 5x+0.004 4，R2=0.990 8，線性關系良好，可用于測定還原糖含量，結果見圖1。

1.3.3 桑黃提取液總三萜含量的測定

參考文獻方法[17]，測定桑黃提取液總三萜的含量：精密稱取白樺酯醇標準品0.02 g，95%乙醇溶解，定容至100 mL，搖勻即得濃度0.2 mg/mL的標準儲備液。精密量取 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 的標準儲備液，分別置于編號為0～6的10 mL離心管中，70℃水浴蒸干。加0.20 mL新配制的5%香草醛冰醋酸溶液，再加入高氯酸0.80 mL，搖勻，70℃恒溫水浴20 min，立即冷水冷卻，用乙酸乙酯定容至5 mL，搖勻，在551 nm處測定OD值。以0號管為對照，繪制總三萜標準曲線，曲線回歸方程為y=11.726x+0.015 5，R2=0.995，線性關系良好，可以用于測定口服液的總三萜含量。結果見圖2。

圖2 測定總三萜含量的標準曲線Fig.2 Standard curve of total triterpenes

1.3.4 桑黃提取液核酸含量的測定

參考文獻[18]，用朗伯-比爾光吸收定律測定桑黃提取液的核酸的含量：核酸嘌呤和嘧啶間的共軛雙鍵，在260 nm處具有最大的吸收峰，測定產品中的核酸含量。

1.3.5 桑黃凍干粉DPPH自由基清除率測定

參考文獻[19]，測定清除DPPH自由基的能力。分別精密吸取水提、醇提的桑黃提取液各0.1 mL，加95%乙醇至3 mL，混勻后加3 mL DPPH自由基溶液，搖勻，25℃避光放置30 min，在517 nm處測定OD值（Ai）。分別精密吸取水提、醇提的桑黃提取液各0.1mL，加95%乙醇至6 mL，搖勻，于室溫（25℃）避光放置30 min，在波長517 nm處測定OD值（Aj）。精密吸取3 mL 95%乙醇溶液和3 mL DPPH溶液置于試管，25℃避光放置30 min，在517 nm處測定OD（Ae）值。每組試驗3個平行，DPPH自由基清除率（I）的計算公式如下。

根據不同提取物的濃度與清除率間關系，計算出IC50值，比較該值的大小。IC50值越低，抗氧化劑的DPPH自由基清除能力越強，抗氧化性就越好。

1.3.6 桑黃凍干粉Fe3+還原活性測定

參考文獻[20-21]，測定還原能力，精密量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 的 0.2 mg/mL 蘆丁標準品溶液，分別加入95%乙醇至1mL，再依次加入2.5 mL磷酸緩沖液、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后封口，置50℃水浴20 min；然后快速冷卻，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻，4 000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液，依次加入2.5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，于700 nm測定OD值。作還原能力標準曲線，曲線回歸方程為y=0.810 1x+0.221 5，R2=0.998 6，線性關系良好，可用于測定桑黃產品的還原能力，結果見圖3。

圖3 測定還原能力的標準曲線Fig.3 Standard curve for determination of reduction capacity

再根據不同提取物的濃度與還原能力關系，計算出IC50值，比較該值的大小。IC50值越低，抗氧化劑的還原能力越強。

1.3.7 桑黃凍干粉抑菌作用的測定

菌種的活化及菌懸液的制備，參考張倩等[22]、魏思敏等[23]的方法稍加改進。分別取100 μL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌低溫保存菌株接種至LB液體培養基，于35℃、120 r/min條件下振蕩培養48 h進行活化。再分別取活化的菌液5 mL于離心管，4℃、12 000 r/min條件下離心2 min得到菌體沉淀。然后加無菌生理鹽水懸浮，最后稀釋得到107CFU/mL～108CFU/mL的菌懸液，振蕩均勻備用。

參考最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定方法[24-25]：將 pH7 的 LB 液體培養基分裝24支試管，每管各3 mL，高壓蒸氣121℃滅菌20 min。以二倍稀釋法進行無菌操作，每3根試管為一組，分別加入20 mg/mL的桑黃凍干粉樣品液3 mL，搖勻，平行吸取3 mL于下一組試管，依次類推，至第6組試管棄去3 mL液體，每組2根試管中加入0.2 mL菌液，1根試管加0.2 mL液體（水提組加無菌水，醇提組加95%乙醇）作為組內空白。第7組試管加0.2 mL液體（水提組加無菌水，醇提組加95%乙醇）作為試驗空白組，第8組加入0.2 mL菌液作為陰性對照。將試管充分搖勻，置于35℃培養24 h，觀察濁度并于600 nm處測定OD值。

1.4 試驗設計與統計分析

用SPSS 25.0軟件先進行正態性檢驗，符合正態性的進行方差分析，圖用Origin 9、Excel繪制。

2 結果與分析

2.1 制備工藝對桑黃提取液得率和凍干粉得率的影響

比較4種制備方法桑黃口服液得率、凍干粉得率的不同影響，試驗數據經Shapiro-Wilk正態性檢驗，得到各組的P＞0.05，符合正態性，可選擇單因素方差法進行統計分析，組間差異性的比較用法，結果見表1。

表1 桑黃提取液得率的比較（n=3）Table 1Yield of P.igniarius extract（n=3）

如表1所示，4種不同提取方式對桑黃提取液得率無顯著性影響（P＞0.05）。提取液凍干后，各組間凍干粉的得率有極顯著性差異性（P≤0.01），其中，“醇提桑黃+木瓜酵素”凍干粉得率最高為（2.07±0.002）%，“桑黃+諾麗果酵素”水提液的得率最低為（0.21±0.002）%。

2.2 制備工藝對桑黃提取液液多糖含量的影響

測定4種不同提取工藝制備的樣品溶液OD490nm值，根據建立的回歸方程得到各樣品的多糖含量。各組經Shapiro-Wilk正態性檢驗，均有P＞0.05，符合正態性，因此可選擇單因素方差分析，比較各組間多糖含量差異的顯著性用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法，結果見表2。

表2 桑黃提取液的多糖含量（n=3）Table 2 Extract of polysaccharide from P.igniarius（n=3）

如表2所示，與桑黃水提或醇提后加入諾麗果酵素比較，桑黃水提或醇提后加入木瓜酵素，提取液多糖含量的差異性極顯著（P=0.001≤0.01），桑黃水提或醇提后加入同種酵素，提取液多糖含量的差異性不顯著（P＞0.05）。即不同提取工藝，桑黃水提、乙醇的提取液中，加入木瓜酵素后的多糖含量差異性不顯著（P=0.883＞0.05），加入諾麗果酵素后的多糖含量差異性也不顯著（P=0.076＞0.05）。4種不同提取工藝中，提取液多糖含量最高的為“桑黃水提后加入木瓜酵素”，為（6.04±0.35）mg/mL，最低為“桑黃水提后加入諾麗果酵素”的（0.54±0.48）mg/mL。

2.3 生產工藝對提取液總三萜含量的影響

測定4種不同提取工藝制備的樣品溶液OD551nm值，根據建立的回歸方程得到各樣品的總三萜含量。各組經Shapiro-Wilk正態性檢驗，均有P＞0.05，因此符合正態性，可選擇“單因素方差分析”分析4種提取方式桑黃提取液的總三萜含量有無顯著差異，結果見表3。

表3 桑黃提取物總三萜的含量（n=3）Table 3 Extract of total triterpenoid from P.igniarius（n=3）

如表3所示，除“水提后加入木瓜酵素”和“水提加入諾麗果酵素”組間差異性不顯著（P=0.244＞0.05）外，其他組間的差異性均為極顯著（P=0.000≤0.01）。其中，“醇提后加入木瓜酵素”的桑黃提取液的總三萜含量最高[（1.77±0.061）mg/mL]，“水提后加入諾麗果酵素”的提取液，總三萜含量最低[（0.73±0.013）mg/mL]。

2.4 制備工藝對桑黃提取液液核酸含量的影響

分析4種提取方式桑黃提取液核酸含量有無顯著差異，各組經Shapiro-Wilk正態性檢驗，均有P＞0.05，因此符合正態性，可選擇單因素方差分析，組間比較用LSD法，結果見表4。

表4 桑黃提取液的核酸含量（n=3）Table 4 Extract of nucleic acid from P.igniarius（n=3）

如表4所示，“醇提后加入諾麗果酵素”組與“水提后加入木瓜酵素”存在顯著性差異（P=0.015≤0.05），“醇提后加入諾麗果酵素”組與“水提后加入諾麗果酵素”存在顯著性差異（P=0.029≤0.05），而“醇提后加入諾麗果酵素或木瓜酵素”組間不存在差異（P=0.422＞0.05）。其中“水提后加入木瓜酵素”桑黃提取液的核酸含量最高，為（210.70±7.23）μg/mL，“醇提后加入諾麗果酵素”組桑黃提取液的核酸含量最低，為（195.81±2.20）μg/mL。

2.5 桑黃凍干粉DPPH自由基清除率的影響

DPPH自由基是一種以氮為中心的活潑自由基，在抗氧化劑存在時能迅速地與之配對并被其清除，是實驗室鑒定抗氧化能力常用的研究方法之一[26]。用其測定水提、醇提的桑黃提取液凍干粉的抗氧化活性，結果見圖4。

圖4 桑黃凍干粉清除DPPH自由基的活性Fig.4 Activity of DPPH free radical eliminating of P.igniarius lyophilized powder

如圖4所示，隨著樣品濃度的升高，桑黃提取液凍干粉的清除能力增強，濃度與清除能力均呈現正相關。在相同的濃度（12.50 mg/mL）下，DPPH自由基的清除率有差異，醇提的為62.10%、水提的為9.79%，因此，桑黃提取液DPPH自由基清除能力，醇提明顯高于水提，桑黃用醇提表現出更良好的抗氧化活性。

2.6 桑黃對Fe3+還原活性的影響

桑黃提取液Fe3+還原活性，表明桑黃提取液的總還原能力，可用來表明樣品的抗氧化能力[27]。因此是實驗室測定抗氧化能力常用的研究方法之一，用其測定水提、醇提的桑黃提取液凍干粉的抗氧化活性，結果見圖5。

圖5 桑黃凍干粉Fe3+還原活性Fig.5 Activity of Fe3+reducing capacity of P.igniarius lyophilized powder

如圖5所示，隨著樣品濃度的升高，水提和醇提兩種提取方式的桑黃提取液，還原能力都增加，濃度與還原力均呈現正相關。在相同濃度（125.0mg/mL），Fe3+還原活性，醇提為55.61%，水提為24.46%，醇提明顯高于水提，說明桑黃醇提取液清除Fe3+還原活性明顯高于水提，因此，桑黃醇提比水提表現出更良好的抗氧化活性。

2.7 桑黃凍干粉對抑菌活性的影響

經比濁法測定抑菌作用的方法得，水提和醇提桑黃提取液凍干粉分別測定對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用，結果見圖6。

圖6 不同桑黃凍干粉對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌率變化Fig.6 Inhabition rate of E.coli and S.aureus of P.igniarius lyophilized powder

如圖6所示，桑黃提取液的濃度-抑菌能力呈現正相關。研究表明，桑黃水提物濃度（2.5 mg/mL）對金黃色葡萄球菌的抑制率為30%，對大腸桿菌的抑制率為31%。而桑黃醇提物濃度（2.5 mg/mL）對大腸桿菌的抑制率為100%，對金黃色葡萄球菌的抑制率為54%。證實在不同提取方式相同濃度下，醇提對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現出較良好的抑菌活性并且抑菌活性醇提強于水提。

3 結論

桑黃的藥用功效成分最早記載于《本草綱木》，具有化飲、止血、止瀉、活血等功效[28]，其良好的藥效作用被大量報道，但是，缺少工藝條件對功效成分、功能的影響研究。氧化損傷是引起衰老、細胞癌變的原因之一，天然低毒的抗氧化抑菌產品，具有潛在的開發價值。本試驗研究桑黃提取液的提取工藝，對功效成分、抗氧化和抑菌活性的影響，優化桑黃提取液的提取工藝，以便在產品開發中發揮更有效的作用。

研究結果表明，桑黃提取液的4種制備方式對提取液的得率無顯著性影響，但是，凍干粉的得率中，“醇提后加入木瓜酵素”組最高（2.07%），“水提后加入諾麗果酵素”組最低（0.21%），組間具有極顯著性差異。桑黃提取液4種制備方式中，水提后加入木瓜酵素的桑黃多糖（6.04 mg/mL）和核酸（210.70 mg/mL）含量最高，“水提后加入諾麗果酵素”多糖含量最低（0.54 mg/mL），“醇提后加入諾麗果酵素”核酸含量最低（195.81 mg/mL）。“醇提后加入木瓜酵素”的總三萜含量最高（1.77 mg/mL），“水提后加入諾麗果酵素”總三萜含量最低（0.73 mg/mL）。

研究結果表明，桑黃提取液的抗氧化和抑菌功能與工藝有關。用DPPH法和Fe3+還原活性法比較桑黃水提和醇提的抗氧化活性，結果表明，醇提DPPH自由基清除能力IC50=9.90 mg/mL，Fe3+還原活性IC50=10.58 mg/mL，因此醇提桑黃提取物抗氧化活性顯著高于水提。用比濁法比較桑黃醇提和水提的抑菌活性，結果表明，桑黃對革蘭氏陰性菌和陽性菌均具有抑菌效果，醇提桑黃提取物抑菌活性顯著高于水提，且醇提提取物對革蘭氏陰性（大腸桿菌）抗菌活性更顯著。