抗菌劑結合熱處理在食源性致病菌滅活中的應用及展望

王曉芳，張若鴻，王純，李曉然，楊洋*，崔生輝，郭云昌

（1.河北科技師范學院食品科技學院，河北 秦皇島 066600；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；3.國家食品安全風險評估中心，北京 100022）

致病菌往往會導致食源性疾病的發生，給公共健康、社會穩定、食品行業的發展帶來巨大危害。為降低食品中微生物風險，食品加工過程中通常添加抗菌劑來保證食品安全[1]。清潔標簽是指在產品標簽中盡可能少地出現食品添加劑，保持食品配料欄中的食品天然的屬性。因此從天然產物中獲取有效抗菌成分意義重大。目前常見的清潔標簽天然抗菌劑可從自然來源中獲得，主要包括植物源（植物精油及成分、茶多酚）、動物源（殼聚糖、蜂膠）和微生物源（細菌素，特別是乳酸鏈球菌素）。天然抗菌劑在食品領域也得到了一定的應用，例如植物精油，常從植物的葉、芽、草本、果實、根和花中提取，不僅具有抑菌或殺菌功效，還有抗氧化和抗癌作用[2]，符合美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）公認安全類產品（generally regarded as safe，GRAS）認證要求。精油成分復雜多樣，也有多個抗菌功能位點，現研究認為可能是通過破壞細菌細胞膜、損傷核酸和控制代謝活動等發揮抗菌活性，其確切作用機制有待進一步闡明。

隨著消費者食品安全意識的提升，抗菌劑和熱處理組成的柵欄技術在推動綠色產業發展方面有了更廣闊的市場前景。熱處理作為一種常見的商業化殺菌技術，通常指將產品加熱至一定溫度以抑制有害微生物的生長，其殺菌效果較好。研究表明，加熱能破壞細菌細胞膜，增加細菌細胞膜和磷脂雙分子層的流動性，這種增加的流動性有助于促進抗菌物質的滲透，并在細胞內具有殺菌作用[3]。將抗菌劑與熱處理結合能避免較高的殺菌溫度，防止對產品造成熱損傷，改善食品的感官品質，抑制食源性致病菌的生成。

近年來，國內外研究者對抗菌劑與熱處理結合的滅菌效果進行了大量研究，發現協同效應可以增強滅菌效果，從而降低抗菌劑的濃度、加熱溫度及時間，在0.01%或更低濃度下就能起作用[4]。不僅解決加工成本問題，而且減少了高濃度抗菌劑對產品感官和風味的影響。本文以檢測微生物的培養基（緩沖溶液、胰蛋白胨大豆肉湯和腦心浸液肉湯）和食品基質（果蔬汁、新鮮及鮮切果蔬、薩爾薩辣醬和蛋液）為線索，結合國內外最新研究成果對天然抗菌劑與溫和熱處理結合對食源性致病菌滅活的協同影響及機理進行綜述，為天然抗菌劑開發利用提供理論參考。

1 抗菌劑和熱處理的聯合應用

1.1 抗菌劑和熱處理結合在緩沖溶液中的應用

表1介紹了以緩沖溶液為處理介質，多種天然抗菌劑和溫和熱處理結合在緩沖溶液中的應用。

表1 抗菌劑和熱處理結合在緩沖溶液中的應用Table 1 Application of antimicrobial agents and heat treatment in buffer solution

為更深入地研究抗菌劑和熱處理滅活食源性致病菌的機理和動力學，在對真實食品進行進一步研究之前，會優先在實驗室模型培養基中進行測試，以便獲得可行性的結果。目前檸檬酸磷酸鹽緩沖液介質的大腸桿菌O157∶H7、單核細胞增生李斯特氏菌不同菌株的滅活效果已被鑒定和報道（表1）。可以采用各種緩沖溶液模擬食品類型。Luis-Villaroya等[3]用pH4.0的Mcllvaine緩沖液（1 000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625mL0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液pH4.0）模擬果汁，當熱處理和天然抗菌劑蜂膠結合時，對大腸桿菌O157:H7 Sakai菌株具有很強的協同殺傷作用，滅活時間從對照組44 min縮短至1 min。據報道，熱量可能會促進蜂膠成分擴散到細胞膜的脂質相，使它們能夠穿透細胞并在細胞質中發揮作用。Gayán 等[8]用 2-（N-嗎啉代）乙磺酸緩沖液作為椰汁的模型系統，檸檬醛、香芹酚和t-肉桂醛對大腸桿菌 O157∶H7（MG1655）菌株的熱失活有明顯的促進作用，協同提高了大腸桿菌O157∶H7（MG1655）菌株的熱失活率，但只有香芹酚是唯一一種與熱處理聯合作用對大腸桿菌所有抗性突變體保持協同作用的化合物，因此，熱處理和香芹酚似乎能抵消抗性菌株耐熱性的發展。此外，乳酸鏈球菌素作為一種天然抗菌劑，結合熱處理可有效控制大量微生物，但是當考慮細菌孢子時，它們似乎對直接添加到加熱介質中的抗菌劑不敏感，只有將其添加到復蘇培養基中時，才能觀察到菌株表面的耐熱性有所下降[9-10]。Ros-chumillas等[11]在磷酸鹽緩沖溶液中，研究乳酸鏈球菌素和熱處理對生孢梭菌孢子的耐熱性，結果表明乳酸鏈球菌素與熱處理的結合加速了生孢梭菌的失活，乳酸鏈球菌素和熱處理有協同作用[10]，這與先前的結果一致。研究顯示，乳酸鏈球菌素可通過孔的形成促進在細菌孢子本身含有的二吡啶甲酸的釋放，破壞其結構完整性并加速其失活過程。

1.2 抗菌劑和熱處理結合在腦心浸液肉湯和胰蛋白胨大豆肉湯中的應用

利用腦心浸液肉湯和胰蛋白胨大豆肉湯為培養介質，研究抗菌劑和熱處理在食品模擬液的熱失活行為。表2列舉了部分抗菌劑與熱處理結合對致病菌的滅活效果。

表2 抗菌劑和熱處理結合在腦心浸液肉湯和胰蛋白胨大豆肉湯的應用Table 2 Application of antimicrobial agents and heat treatment in brain and heart infusion broth and tryptone soy broth

如表2所示，抗菌劑與熱處理之間的協同效應雖然具有廣譜的抗菌性能，但其抗菌效果受多方面因素的影響。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的結構差異決定了它們對抗菌劑和熱處理的敏感性不同。通常情況下，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌對抗菌劑更加敏感，例如，Chen等[16]研究0.6%酵母提取物的胰蛋白酶大豆肉湯中乳酸鏈球菌素、百里酚和乳糖酸聯合對單核細胞增生李斯特氏菌的抗菌效果，結果表明乳糖酸增加了乳酸鏈球菌素、百里酚的抗菌活性，擴大其抗菌譜，完全抑制了單核細胞增生李斯特氏菌的生長，但對大腸桿菌O157:H7沒有協同作用，這可能是革蘭氏陰性菌大腸桿菌O157:H7外膜中的脂多糖為乳酸鏈球菌素的作用提供了屏障[17]。然而另一項研究在胰蛋白胨大豆肉湯中，發現月桂酰精氨酸乙酯（15 μg/mL）和溫和熱處理（55℃）對革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌O157:H7）和革蘭氏陽性菌（如英諾克李斯特氏菌）均表現出協同作用，機制可歸因于月桂酰精氨酸產生的氧化應激，以及溫和熱處理和月桂酰精氨酸乙酯的雙重壓力而加重膜損傷。但如單獨處理，則需要增加約27倍的熱能和2.3倍的月桂酰精氨酸乙酯濃度，才能達到與兩者結合處理相同的5 lg（CFU/mL）大腸桿菌數量[18]。因此，研究微生物應激和毒性反應之間的關系對于抗菌劑的發展是至關重要的。Lanciotti等[19]在腦心浸液肉湯中，評估了單核細胞增生李斯特氏菌Scott A如何調節和形成蛋白質組以對抗檸檬醛、香芹酚、（E）-2-己烯醛和百里香精油的抗菌能力。這項研究表明，不同處理條件其蛋白質組圖譜不同。與檸檬醛和（E）-2-己烯醛相比，香芹酚和百里香精油在蛋白質合成中起到了更高的誘導作用。適應檸檬醛或（E）-2-己烯醛的細菌，在肉湯中表現出更高的存活率。

1.3 抗菌劑和熱處理結合在果蔬汁的應用

為更好地闡明抗菌劑和熱處理技術的抗菌效果，選擇以常見的果蔬汁作為應用載體，正確地比較微生物的抵抗性能是研究此類技術的必要工作。表3總結了幾種常見果蔬汁中抗菌劑和溫和熱處理滅活食源性致病菌的效果。

表3 抗菌劑和熱處理結合在果蔬汁的應用Table 3 Application of antimicrobial agents and heat treatment in fruit and vegetable juice

健康營養的果蔬汁產品作為食品產業的一個重要分支，所占的市場份額仍在不斷擴大。目前大量文獻研究了抗菌劑與熱處理協同抑制細菌或降低細菌熱穩定性的條件及作用效果（見表3），結果表明，熱處理和精油協同作用的程度與溫度有關，在細菌細胞中，熱量對精油組分在細胞質膜中的分配，是影響精油失活動力學的主要原因[24]。Espina等[6]在蘋果汁中處理大腸桿菌O157∶H7時，將檸檬精油與熱處理結合，處理時間從28.5 min減少至5 min，這些協同效應已被解釋為熱損傷細胞的失活。果汁的性質會影響細菌在處理過程中的存活率，尤其是酸性條件下，如自然形成或糖發酵過程中產生的有機酸，能夠誘導致病細菌產生交叉保護反應，形成酸適應性細胞。酸適應能夠誘導至少60種特異性酸休克蛋白的翻譯，以及誘導能提高耐熱性的σ因子[25]，從而增加細菌的抵抗力。Tchuenchieu等[26]在菠蘿汁、橙汁或西瓜汁中，用香芹酚和熱處理對適應酸的非致病大腸桿菌25 922菌株進行檢測，發現適應酸性環境的大腸桿菌O157∶H7細胞在耐熱處理上比未經酸調節的細胞更強。對于食品基質而言，菠蘿汁、橙汁中的一級酸是檸檬酸，西瓜汁中的一級酸是蘋果酸，通常情況下，菠蘿汁和橙汁中大腸桿菌的失活率可能高于西瓜汁。此外，果蔬的獨特組成也是一個非常重要的影響因素，鹽、糖、蛋白質和脂肪等成分可能有助于保護細胞免受熱損傷。當抗菌劑和熱處理結合時，這些基質成分會削弱其抗菌效果，如胡蘿卜汁中的脂肪和纖維成分，在澄清的蘋果汁中并不存在，從而增加了胡蘿卜汁的熱致死時間[27]。

1.4 抗菌劑和熱處理結合在新鮮及鮮切果蔬的應用

表4列舉了新鮮及鮮切果蔬產品中，抗菌劑和熱處理結合對致病菌的滅活效果。

表4 抗菌劑和熱處理結合在新鮮及鮮切果蔬的應用Table 4 Application of antimicrobial agents and heat treatment in fresh and fresh cut produce

新鮮及鮮切果蔬因具有天然、營養以及方便等特點，深受世界各地消費者的青睞。同時，與之相關的食源性疾病暴發的頻率也不斷上升。果蔬產品中微生物風險問題愈發突出，而抗菌劑和熱處理結合在提高果蔬產品的微生物安全性方面顯示出潛在的應用價值。對于鮮切果蔬，切割面的汁液流失是造成微生物感染的主要原因。鮮切西蘭花經50℃熱水處理1.5 min后，然后浸入殼聚糖膜液中，發現采用殼聚糖結合溫和熱處理可使嗜常溫細菌、腸細菌、酵母和霉菌以及乳酸菌顯著降低[31]。用50℃熱水處理芒果30 min，然后采用0.25%殼聚糖進行涂膜包裹，發現單獨采用熱處理和殼聚糖涂膜或者兩者組合對芒果的風味和口感均無顯著影響，熱處理能保持芒果的質地和色澤，殼聚糖可以抑制貯藏期間微生物的生長[32]。新鮮果蔬富含水分和各種營養物質，采后易受微生物污染。例如采后枸杞經42℃熱水處理30 min處理后，用1%殼聚糖涂膜包裹，與未處理的枸杞相比，熱處理和殼聚糖涂膜后的枸杞具有較高的抗壞血酸、總酚含量和抗氧化能力以及較低的腐爛率。其機制可能是熱處理幾乎能封閉果實開放的氣孔，限制致病菌滲透到果實的內部。殼聚糖能控制生物膜的形成，阻止枸杞的二次感染，減緩了果實呼吸和代謝活性的變化[33]。將熱處理與有機酸和H2O2結合對大腸桿菌O157:H7進行商業性試驗，以控制菠菜的采后病害。與對照組相比，這種組合清楚地顯示了柵欄效應的協同作用，整體的失活量超過部分總和。有機酸和H2O2抗菌活性受pH值的影響，可能是酸在低pH值下有利于分子形成不帶電、不離解狀態。此外，懸浮在液體基質中的浮游細胞，可能會附著在固體食物基質上，導致無法進行熱處理和抗菌處理，因此仍需要進一步測試其滅菌策略[28]。

1.5 抗菌劑和熱處理結合在薩爾薩辣醬和蛋液的應用

雞蛋的營養價值很高，在食品加工生產中極易受到污染。因此使用方便、安全性好的蛋液制品日漸引起消費者的關注。表5列舉了抗菌劑和熱處理結合在薩爾薩辣醬和蛋液中的應用。

表5 抗菌劑和熱處理結合在薩爾薩辣醬和蛋液中的應用Table 5 Application of antimicrobial agents and heat treatment in salsa and liquid egg

蛋液是由鮮蛋經加工后制得的液蛋制品，在食品工業中多采用熱處理的方法進行殺菌。但由于加熱會破壞蛋清中熱敏性活性物質，往往導致殺菌效果不理想，溫和熱處理結合抗菌劑對于高價值熱敏性的蛋液以及薩爾薩辣醬可能是較好的滅菌策略，表5介紹了蛋液和薩爾薩辣醬中抗菌劑和溫和熱處理的滅菌效果。溶菌酶可分解細菌細胞壁，具有已知的抗菌特性，尤其是對革蘭氏陽性菌具有較強抗菌活性，使其在食品工業中有著廣泛的應用。Bi等[37]利用熱處理和溶菌酶滅活全蛋液中的鼠傷寒沙門氏菌，兩者表現出明顯的協同作用。雖然加熱易使溶菌酶失活引起酶的空間結構的變化，但是由于溶菌酶的熱變性，某些特定組成氨基酸受到影響，其抗菌活性會得到發展，因此熱處理和溶菌酶具有協同作用。據推測，溶菌酶是通過降解全蛋液的肽聚糖層，才導致鼠傷寒沙門氏菌細胞裂解[38]。與超聲波和溶菌酶處理相比較，當加熱條件為64℃/3 min時，其失活效果是相似的。而不同之處是熱處理和溶菌酶處理全蛋液的L*和b*值顯著低于超聲波和溶菌酶處理的全蛋液，對全蛋液質量的影響仍需深入研究。Sung等[39]研究了溶菌酶和熱處理滅活蛋清液中的炭疽桿菌，發現添加2 mg/mL溶菌酶在60℃，30 min處理條件下，炭疽桿菌的滅活效率提高5.76倍，兩者有效地參與了炭疽桿菌的滅活。此外，溶菌酶滅活炭疽桿菌的能力受蛋清液pH值影響，有數據表明，在45℃和60℃時，接近中性pH值蛋清液能更有效地滅活炭疽桿菌。

2 展望

熱處理作為目前使用較多的物理殺菌方法，仍是現代食品工業中的主要殺菌技術手段。隨著生物技術和人們生活水平的不斷提高，利用健康、安全的抗菌劑來保證食物的天然特性，符合消費者對“清潔標簽”的需求，由此，天然抗菌劑與溫和熱處理聯用的應用前景將十分廣闊。但由于食品基質復雜多樣，該方法在食品安全中的應用仍存在諸多挑戰，未來可以從以下幾個方面進行相關深入研究。

2.1 研發納米抗菌劑的抗菌作用

為解決精油疏水性差及感官特性方面的缺陷，近年來一些研究者發現以納米乳液形式存在的精油及成分結合熱處理的方法，能在不同食品基質中快速、均勻地分布，提高其溶解度和抗致病細菌的活性，如D-檸檬烯以納米乳液的形式處理時，在胰蛋白酶大豆肉湯和蘋果汁中可使單核細胞增生李斯特氏菌的D值由784 min降低至8.13 min（幾乎是對照組的100倍），而山夫登堡沙門氏菌的δ值由32.13 min減少至0.65 min（約50倍）[40-41]。精油納米乳液液滴的大小通常在20 nm～200 nm之間，但由于尺寸較小，可能會改變胃腸道的吸收、分布、代謝和排泄等正常功能[42]，因而產生其潛在毒性效應。目前，納米抗菌劑在食品基質中的毒性、安全性和相互作用方面的研究還很少，液滴大小、聚集狀態、電荷正負、物理狀態和生物活性化合物濃度是評估納米抗菌劑安全風險的主要因素[43]。其相關標準化測試方案仍在制定中，未來應加大控制和管理納米天然抗菌劑相關產品的開發。

2.2 致病菌應激響應分子機制的研究

在對溫和熱處理與抗菌劑的食品加工技術進行優化或開發新的控制措施時，必須考慮細菌的應激反應和交叉保護。致病細菌長時間地暴露在亞致死濃度或溫和熱處理下，會誘導產生突變株，對其他化合物和熱處理表現出交叉抗性[44-45]，借助基因組學、蛋白質組學和代謝組學等組學技術，從分子水平進一步探究基因型的特征及細菌對精油成分的耐藥機制的作用，例如金黃色葡萄球菌USA300對亞抑制劑量的香芹酚或熱的抗性，經全基因組測序后，發現耐藥性菌株的多個編碼基因如DNA結合蛋白、復制蛋白DnaD、外源反應元件家族轉錄調節因子等的缺失，可能與菌體耐受性的增加有關[46]；用雙向凝膠電泳分析溫和熱處理與香芹酚和百里酚對單核細胞增生李斯特氏菌細胞的蛋白表達，發現在應激條件下誘導的蛋白質與這些細胞的應激反應、新陳代謝及蛋白質合成、蛋白質折疊、蛋白酶活性的變異有關。為了抵抗外界環境壓力，參與能量代謝的蛋白質過度表達，能補充因與細菌細胞質膜作用的應激反應而受損的部分能量；涉及熱應激反應的蛋白伴侶，能協助折疊、組裝熱損傷細胞的蛋白質和蛋白酶[12]，為抗菌劑和熱處理結合在各種食品安全上的使用奠定基礎。同時，還應避免添加亞致死濃度的抗菌劑劑量，在亞致死濃度之前減緩致病菌的生長，則有可能消除這些致病菌的應激反應。

2.3 抗菌劑和熱處理結合在鮮切果蔬產業的開發應用

目前，天然抗菌劑在鮮切果蔬產業領域的研究已取得不小的成就，在國內外研究較多的天然有機抗菌劑是殼聚糖和植物精油，可作為化學消毒技術的有效替代品。溫和的熱處理方法能誘導宿主產生不同的植物防御系統，如細胞壁的強化和氣孔的堵塞（裂縫是致病菌的主要入侵點），以及應激蛋白（如熱休克蛋白、病原相關蛋白）和抗氧化酶的積累[47]，有效地控制水中致病菌在鮮切過程中的遷移。目前天然抗菌劑在果蔬產業領域中的研究大多數僅限于理論或者實驗室階段，距離產業化應用仍有一段距離。主要存在的問題如下：有關殼聚糖、精油等作用機理的研究尚不透徹，對天然抗菌劑抗菌效果的評價和檢測方法不統一，天然抗菌物質的產地、品種、活性成分等對果蔬的抗菌作用有很大差異，其確切作用機制還有待進一步研究。此外，細菌在植物細胞內化的轉運機制還尚不清楚。當清洗消毒劑和果蔬產品之間存在溫度差時，細菌易通過細胞間組織、角質層的氣孔或受損（傷口、切口）部位進入鮮切果蔬組織，引起致病菌內化[48]。有研究稱細菌的附著和內化依賴于細菌和植物因素，細菌因素包括細菌濃度、細菌菌株和生物膜的形成；植物因素包括植物品種、浸染部位、生長條件[49]。未來應建立精確評估、預測和控制微生物的數學模型，利用先進的顯微成像和分析工具識別影響微生物存活的關鍵因素，建立和優化工藝條件及處理參數，從而構建目標菌株的預測失活模型[50]，在適當的條件下有效地提高果蔬的安全性。為滿足工業應用的要求，需要進一步提高這些技術的抗菌效率，從而降低成本。

3 結語

綜上所述，復合型抗菌劑相比于單一抗菌劑在較小用量下具有較優的抑菌效果，真實食品基質觀察到的結果可能比使用緩沖溶液或肉湯稀釋系列更有用，這將充分體現出抗菌劑和熱處理技術的實用性。研究證明，天然生物活性抗菌劑和溫和熱處理具有協同的抗菌作用，可有效滅活致病性大腸桿菌、沙門氏菌等食源性致病菌，優化柵欄技術在加工食品中的應用。添加低劑量的抗菌劑，能夠減少對食品感官特性的影響，增強與熱處理協同作用的殺菌效果，使得在溫和的條件下實現滅菌作用。因此，抗菌劑與熱處理形成的協同效應，可明顯縮短致病菌的熱致死時間，降低食源性致病菌的污染水平與頻率，對于有效預防和控制食源性疾病暴發具有重要意義。