穗花狐尾藻種植水對銅綠微囊藻的影響

高云霓，武 靜，楊 惠，張 方，劉 暢，駱琨峰

(河南師范大學水產學院，河南 新鄉 453007)

化感作用是沉水植物與藻類相互作用的重要方式，是影響淺水湖泊穩態轉換和沉水植被恢復重建的重要機制之一[1-3]。相對于綠藻等真核藻類，沉水植物可以通過釋放化感物質對銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)等藍藻產生較強的抑制作用[4]。穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)被認為是化感抑藻活性最強的沉水植物[1,3-5]。相比硅藻和綠藻，穗花狐尾藻化感物質對藍藻銅綠微囊藻生長的抑制作用最強[6]。圍隔試驗證實，水中藍藻生物量被種植的穗花狐尾藻持續抑制[7]。穗花狐尾藻化感物質沒食子酸持續暴露期間，藍藻生物量被顯著抑制，而綠藻、褐藻和隱藻沒有受到明顯影響[8]。

自然水體中，沉水植物和藻類此消彼長過程同時還會受到營養環境條件的影響[9-10]。從生態系統的層面，隨著富營養化進程的加劇，許多淺水湖泊逐步由水生植物占優勢的清水穩態轉變為浮游藻類占優勢的濁水態[10-12]。不同營養水平湖泊中穗花狐尾藻代謝物指紋圖譜顯著不同[12]，銅綠微囊藻的生長和毒素合成水平也不同[13-14]。自然水體中沉水植物對藻類的化感作用過程不可避免也會受到營養環境條件的影響，但由于水體生物非生物環境的復雜性，相關研究還比較少。葛芳杰等[15-16]前期研究發現穗花狐尾藻體內酚酸類化感物質的合成會受到光照、氮磷營養水平的調節。不同光照和溫度下銅綠微囊藻對化感物質的生長響應顯著不同[17]。但不同營養環境條件下沉水植物對銅綠微囊藻的化感作用效應，目前還不清楚。

為進一步明確自然水體中沉水植物種植水對藍藻化感作用的影響，選取室外條件下自然繁殖生長的穗花狐尾藻種植水，通過比較常見的藍藻水華優勢種銅綠微囊藻產毒株和非產毒株對營養加富和穗花狐尾藻原種植水的生長生理響應，初步分析營養環境和穗花狐尾藻釋放到水中的化感物質對銅綠微囊藻的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源與培養

試驗藻種銅綠微囊藻產毒株(FACHB 905)和非產毒株(FACHB 526)均購自中國科學院淡水藻種庫。無菌BG11培養基培養，光照強度為2 000 lx，光暗周期為12 h∶12 h，溫度為(25±1) ℃，每天手動定時搖瓶3次，每隔7 d重新接種1次，連續多代馴化培養，待反映藻細胞最大光合活性的葉綠素熒光參數Fv/Fm值穩定在0.40以上，即可用于正式試驗。

穗花狐尾藻2018年采自湖北洪湖，栽種于河南師范大學水產學院基地種植桶中。種植桶中鋪 10 cm 底泥，添加自來水自然條件下培養，2019年春季自然繁殖生長，選取長勢良好，無其他植物干擾的種植桶，于8月連續晴天一周后采集穗花狐尾藻種植水用于正式試驗。測得種植桶中穗花狐尾藻植物質量濃度約為1.0 g/L，其中底泥為水產基地曬干后的塘泥，測得總碳、總氮和總磷質量比分別為 16.40 g/kg、0.89 g/kg和0.80 g/kg。

1.2 試驗設計

采集的穗花狐尾藻種植水抽濾過0.22 μm孔徑的濾膜，去除顆粒雜質和微生物干擾后用于抑藻試驗。試驗設置2個穗花狐尾藻種植水處理組：第1組為營養加富組，受試藻暴露在添加了無菌BG11培養基的穗花狐尾藻種植水中，測得水中總碳、總氮和總磷質量濃度分別為(35.07±0.67) mg/L、(248.61±0.01) mg/L和(7.25±0.02) mg/L；第2組為原種植水組，直接在制備好的穗花狐尾藻種植水中添加受試藻細胞，測得水中總碳、總氮、總磷質量濃度分別為(32.81±0.67) mg/L、(1.61±0.01) mg/L 和(0.12±0.02) mg/L。同時，每株藻均設置未添加穗花狐尾藻種植水的對照組，在無菌BG11培養基中正常培養。每組均設置3個平行試驗。

種植水制備和銅綠微囊藻接種均在無菌操作臺上進行，所用器皿均提前做好滅菌處理。試驗在250 mL錐形瓶中進行，瓶中加入100 mL種植水或BG 11培養基，接種指數生長期的銅綠微囊藻藻細胞，起始密度在3.0×105～4.0×105個/mL范圍內，相當于680 nm處吸光度(OD680)值約0.03，搖勻，透氣膜封口后，移至光照培養箱按上述條件持續培養 9 d，每天手動搖勻3次，避免藻細胞沉底和營養光照不均。

在接種后0 d、3 d、6 d、9 d分別取樣測定各培養瓶中的銅綠微囊藻OD680值，計數藻細胞密度，測定銅綠微囊藻葉綠素熒光參數(Fv/Fm、ФPSⅡ)和膜脂過氧化產物丙二醛(MDA)的濃度。其中Fv/Fm指光合系統Ⅱ(PSⅡ)的最大光合效率，是PSⅡ光化學反應可能達到的最大產量的評估；ФPSⅡ是PSⅡ的實際光合效率，表示開放的反應中心捕獲實際激發能的效率[18]。

1.3 指標測定方法

銅綠微囊藻OD680值用紫外-可見分光光度計(UV752，上海佑科)測定，藻細胞密度用浮游植物計數框在光學顯微鏡(E100, Nikon Eclipse)下計數。Fv/Fm和ФPSⅡ用掌上水體葉綠素熒光儀(AquaPen AP110-C,捷克)在室溫下將樣品置于黑暗中20 min后測定[19]。MDA濃度用南京建成生物試劑盒測定。種植水中營養鹽總磷和總氮質量濃度分別采用中性和堿性過硫酸鉀消解，紫外-可見分光光度計(UV752，上海佑科)測定，總碳質量濃度使用TOC有機碳含量分析儀(multi 3100)測定[20]。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2016軟件分析數據和繪圖，數據均以“平均值±標準差”的形式表示。穗花狐尾藻種植水對銅綠微囊藻產毒株和非產毒株OD680值、藻細胞密度、Fv/Fm和ФPSⅡ的抑制率按式(1)計算，對MDA濃度的促進率按式(2)計算。

(1)

(2)

式中：Y、Z分別為抑制率和促進率；AC、AT分別為某項指標在對照組和處理組中同一時間的數值。

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，組間差異顯著性采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 銅綠微囊藻的生長響應

銅綠微囊藻OD680值和細胞密度測定結果均顯示穗花狐尾藻種植水對兩株藻的生長有顯著抑制作用(P<0.05)。沒有添加種植水的對照組中產毒株和非產毒株OD680值9 d時分別增大了15.7倍和14.7倍。添加穗花狐尾藻種植水的處理組銅綠微囊藻OD680值增幅顯著低于對照組，其中營養加富種植水組產毒株和非產毒株OD680值9 d時分別增大12.3倍和13.6倍，原種植水組增幅最小，分別增大3.7倍和7.3倍(圖1)。與對照組OD680值相比，9 d時營養加富種植水對產毒株和非產毒株生長的平均抑制率分別為21.3%和6.9%，原種植水則分別為77.5%和50.5%。

(a) 產毒株

(b) 非產毒株

對照組中銅綠微囊藻產毒株和非產毒株藻細胞密度9 d分別增加了21.0倍和18.9倍，而營養加富組藻細胞密度分別增大了18.1倍和16.1倍，原種植水組分別增大了10.5倍和11.9倍，添加了穗花狐尾藻種植水的處理組中藻細胞密度顯著降低(P<0.05)(圖2)。與對照組藻細胞密度相比，營養加富種植水對產毒株和非產毒株生長抑制率分別為23.5%和20.9%，原種植水分別為60.7%和49.3%。銅綠微囊藻OD680值和細胞計數的結果均顯示，未添加BG11培養基的穗花狐尾藻原種植水對產毒株和非產毒株銅綠微囊藻生長的抑制作用顯著增強(P<0.05)。

(a) 產毒株

(b) 非產毒株

2.2 銅綠微囊藻葉綠素熒光參數變化

穗花狐尾藻種植水對銅綠微囊藻產毒株和非產毒株Fv/Fm和ФPSⅡ表現出一定程度的抑制。對照組中產毒株和非產毒株Fv/Fm值試驗期間分別保持在0.57～0.61和0.56～0.59之間(圖3)。與對照組相比，9 d時營養加富種植水對產毒株和非產毒株Fv/Fm值的平均抑制率分別為3.2%和3.8%，原種植水則分別為4.7%和8.7%。

(a) 產毒株

(b) 非產毒株

試驗期間對照組銅綠微囊藻產毒株和非產毒株ФPSⅡ值分別保持在0.56～0.68和0.49～0.63之間，光合活性高(圖4)。與對照組相比，穗花狐尾藻種植水對產毒株和非產毒株ФPSⅡ具有顯著的抑制作用。9 d時營養加富種植水對產毒株和非產毒ФPSⅡ的平均抑制率分別為7.4%和17.6%，原種植水分別為15.4%和23.4%。葉綠素熒光參數結果顯示，未添加BG11培養基的穗花狐尾藻原種植水對產毒株和非產毒株生長的抑制作用顯著增強(P<0.05)。

(a) 產毒株

(b) 非產毒株

2.3 銅綠微囊藻MDA濃度變化

添加穗花狐尾藻種植水后，銅綠微囊藻產毒株和非產毒株MDA濃度顯著增大(P<0.05，圖5)。對照組中，產毒株MDA濃度由開始時的 0.59 nmol/L 上升到9 d時的1.38 nmol/L，非產毒株MDA濃度則由0.93 nmol/L上升至1.69 nmol/L。與對照組相比，營養加富組產毒株和非產毒株MDA濃度9 d時分別增大5.6%和9.1%，原種植水組分別增大11.1%和18.2%。

(a) 產毒株

(b) 非產毒株

3 討 論

排除營養限制、懸浮物和微生物干擾的營養加富穗花狐尾藻種植水對銅綠微囊藻產毒株和非產毒株的生長過程具有明顯的抑制作用，抑制率大部分在20%左右，說明穗花狐尾藻可能釋放化感活性物質抑制銅綠微囊藻生長。而穗花狐尾藻原種植水對銅綠微囊藻生長的抑制率在50%左右。原種植水中總氮質量濃度均值為1.61 mg/L，總磷為 0.12 mg/L，相當于湖泊Ⅳ類水標準。1992—2012年太湖總氮質量濃度年均值介于1.5～3.0 mg/L之間，總磷在0.05～0.15 mg/L之間，微囊藻占優勢的藍藻水華依然嚴重[21]。在暴發微囊藻水華的巢湖夏季總氮和總磷質量濃度分別為1.27～3.96 mg/L和0.044～0.200 mg/L[22]。營養加富種植水中總碳、總氮和總磷質量濃度分別為55.45 mg/L、248.67 mg/L 和7.24 mg/L，碳氮磷營養水平分別增大了1.7倍、153.5倍和59.3倍，顯著高于常年暴發藍藻水華的太湖和滇池[21，23]；同時鐵、錳等藻類生長所需的各種微量元素也得到了補充。銅綠微囊藻生態適應性很強，在較寬的營養范圍內均可以生長，能耐受超富營養水平[24-25]。本試驗中受試的銅綠微囊藻長期在室內BG11培養基中生長，盡管原種植水中的營養水平不低，但營養組成和濃度水平與BG11培養基有顯著差別，臨時改變微囊藻生長的營養環境，可能會影響銅綠微囊藻的生長生理活動。若微量元素如鐵受限制，銅綠微囊藻產毒株的生長和毒素合成會受影響[26]。由此可見，穗花狐尾藻生長的低營養環境及其釋放并遺留在水中的化感物質的共同作用，是穗花狐尾藻抑制銅綠微囊藻生長、影響其生理過程的原因，但具體的影響機制有待深入研究。

富營養水體中水華藍藻通常是產毒株和非產毒株共存[27]。銅綠微囊藻產毒株能合成并釋放微囊藻毒素到水環境中，對其他水生生物產生毒害作用，飲用水源地中若含有產毒微囊藻，其釋放到水環境中的藻毒素則會威脅飲水安全和人類健康[28]。已有研究顯示，銅綠微囊藻產毒株通常在溫度升高或氮磷濃度水平增加的情況下比非產毒株生長繁殖更快[29-30]。產毒株在低CO2水平下具有優勢，而非產毒株可以在低光照條件下生長，并在高CO2水平下占據競爭優勢[31]。本文試驗結果顯示穗花狐尾藻種植水對產毒株和非產毒株的生長均有顯著抑制作用，且產毒株比非產毒株更敏感。穗花狐尾藻化感物質焦酚對銅綠微囊藻產毒株的抑制效果也高于非產毒株[32]。這為利用沉水植物化感物質降低產毒微囊藻比例，優化微囊藻種群結構，從而降低微囊藻毒素合成和釋放水平，減輕其生態危害，提供了一種思路。

相對于生長指標，穗花狐尾藻種植水對銅綠微囊藻光合作用效能和膜脂過氧化水平的影響在試驗結束時較低，但在試驗前3 d大部分指標已表現出與對照組的顯著差異，進一步從生理響應層面證實穗花狐尾藻種植水對產毒株和非產毒株的抑制效應。但產毒株和非產毒株的生理響應規律并非完全一致，具體表現在穗花狐尾藻種植水對銅綠微囊藻產毒株葉綠素熒光參數的抑制效果較弱，明顯低于對非產毒株的影響，而對產毒株的膜脂過氧化水平的誘導在試驗前期顯著高于非產毒株。這有可能與產毒株和非產毒株對穗花狐尾藻種植水的生理響應機制不同有關。鐵限制條件下產毒株藻毒素合成增強，氮饑餓條件下，非產毒株的光合作用和碳氮代謝蛋白質更加豐富[33-34]。穗花狐尾藻釋放的化感物質中，壬酸對銅綠微囊藻細胞膜有顯著影響，而焦酚會改變酯酶活性，并顯著降低藻細胞內葉綠素熒光強度[35]。穗花狐尾藻種植水中化感物質種類多樣[5,36]，不同營養水平下穗花狐尾藻種植水對銅綠微囊藻細胞的生理代謝過程的影響機理更加復雜，有必要在明確種植水中化感物質的基礎上針對特定營養因子開展系統研究。

4 結 論

a.穗花狐尾藻種植水顯著抑制銅綠微囊藻產毒株和非產株毒的生長(P<0.05)，影響其生理過程，但低營養水平下的抑制作用更強(P<0.05)。

b.營養加富穗花狐尾藻種植水暴露9 d后，對銅綠微囊藻產毒株和非產毒株生長的抑制率分別為23.5%和20.9%，對ФPSⅡ的抑制率分別為7.4%和17.6%，MDA濃度分別增大5.6%和9.1%。

c.穗花狐尾藻原種植水對銅綠微囊藻產毒株和非產毒株生長的抑制率分別為60.7%和49.3%，對ФPSⅡ的抑制率分別為15.4%和23.4%，MDA濃度分別增大11.1%和18.2%。