法薏苡仁延緩衰老的代謝組學初步研究

★李龍雪 黃聲宏 徐鐵龍 劉隆霸 顧洲洋 楊志龍 劉志勇（江西中醫藥大學 南昌 330004）

衰老是機體損傷和防御相拮抗的一個復雜過程，表現為機體結構和功能的衰退，以及抵抗力和修復力的減退。近年來我國人口老齡化程度加深，應對老齡化已上升為國家戰略，抗衰研究逐漸成為一個熱點領域。

亞精胺是生物體內合成的一種代謝物，也見于成熟奶酪、豆類和全谷類等天然食品中。Eisenberg T等［1］研究發現，亞精胺通過激活細胞自噬，延長酵母、蒼蠅、線蟲的壽命，提高人外周血單核細胞的存活率，降低小鼠氧化應激反應發揮其有益的作用。Eisenberg T等［2］研究發現在小鼠飲用水中添加亞精胺可延長它們的壽命，即使在小鼠已達中年時再開始也能產生效果。Liang Y等［3］研究發現，機體衰老過程伴隨著大腦線粒體功能的衰退，通過膳食補充亞精胺可改善線粒體呼吸功能和大腦的衰老進程。因此，研究通過食源性補充亞精胺是一種安全、可靠的延緩衰老方法。

薏苡仁（coicis semen），為禾本科植物薏苡成熟干燥的種仁，功能利水滲濕、健脾止瀉、除痹、排膿、解毒散結。而法薏苡仁是樟幫歷來使用的薏苡仁炮制品, 在《樟樹藥幫中藥傳統炮制法經驗集成及飲片圖鑒》中有記載, 經過了浸制、蒸制和炒制等數種復制而成［4-5］，具有很高的營養價值以及重要的藥用價值［6-8］。現代藥理學研究表明，薏苡仁具有抗腫瘤，增強免疫力，降血脂，鎮痛消炎等作用。薏苡仁經過法制的炮制方法后，祛除了寒涼之性，藥性由涼轉微溫，更適宜老年人群食用。民間常用作保健抗腫瘤提高免疫力的食材自主食用，探討其對衰老的調節作用具有實際意義。

本研究選用退役雌性SD大鼠，運用代謝組學技術研究炮制后薏苡仁（法薏苡仁）對大鼠機體物質代謝的影響，進而探索法薏苡仁延緩衰老的作用，為法薏苡仁的進一步開發利用奠定基礎。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗動物SPF級SD雌性大鼠33只，12月齡大鼠23只，體重（310±30）g，2月齡大鼠10只為青年對照組，體重（200±20）g，由江西中醫藥大學實驗動物科技中心提供，合格證號：SCXK（贛）2018-0003。實驗鼠用飼料原粉和墊料統一由湖北萬千佳興有限公司提供。實驗大鼠飼養在江西中醫藥大學實驗動物科技中心SPF級屏障實驗室內，環境溫度為20~23 ℃、濕度45 %~55 % ，使用許可號為SYXK（贛）2018-0004。

1.2 藥物法薏苡仁粉由江西景德中藥股份有限公司提供。

1.3 試劑質譜級甲醇、乙腈、甲酸購自Anaqua（Wilmington，DE USA）。

1.4 主要儀器高速冷凍臺式離心機（Allegra X-30R Centrifuge）；Triple TOFTM 5600 型液相色譜高分辨串聯質譜儀（美國AB SCIEX 公司，配備 DuoSprayTM 離子源，30A 型液相色譜系統）；超純水機（密理博MILLI-Q-Integral 10）。

2 方法

2.1 樣品配制法薏苡仁高劑量組飼料含法薏苡仁3 %（即每加入291.0 g飼料原粉加入法薏苡仁粉9.0 g）；法薏苡仁低劑量組飼料含法薏苡仁0.5 %（即每加入298.5 g飼料原粉加入法薏苡仁粉1.5 g）；青年對照組和衰老模型組飼料僅為飼料原粉。

2.2 動物分組給藥與臨床觀察SPF級SD退役雌性大鼠33只，12月齡大鼠23只，隨機分為衰老模型組（C）7只、法薏苡仁低劑量組（FL）8只和法薏苡仁高劑量組（FH）8只。2月齡青年對照組大鼠（YC）10只，每天給足量相應飼料和水，連續喂食90 d。期間，觀察實驗大鼠的飲食飲水情況，并觀察毛發以及各組動物的臨床表現。

2.3 尿液采集與處理給藥90 d后用代謝籠隔夜收集4組大鼠12 h的尿液。第91 d腹腔注射3 %戊巴比妥鈉麻醉解剖。

2.4 UPLC-MS/MS

2.4.1 色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相0.1 %甲酸水溶液（A）-乙腈溶液（B）梯度洗脫（0~2 min，5 %~10 %；2~15 min，10 %~25 %；15~28 min，25 %~55 %；28~37 min，55 %~95 %；37~40 min，95 %~5 %），柱溫35 ℃，進樣量5 μL。

2.4.2 質譜條件質譜儀采用ESI源正負離子模式檢測，質譜數據采集時間為40 min，掃描時間900 ms,采集范圍m/z100~1 500 Da，霧化氣壓力50 psi，脫溶劑氣壓力50 psi,氣簾氣流（CUR）40 mL/min，脫溶劑氣溫度500 ℃，離子噴霧電壓5 500 V，去簇電壓（DP）100 V，質譜漂移范圍50 mDa，碰撞能（CE）10 V。

2.4.3 樣品前處理取1 mL尿液樣本，3 000 rpm離心10 min，取300 μL上清液加入900 μL乙腈，2 000 rpm渦旋2 min，4 ℃下13 000 rpm離心15 min，吸取1 mL上清液氮氣吹干，用500 μL 75 %乙腈復溶，4 ℃下13 000 rpm離心后，取適量上清液于進樣瓶中進行檢測。

2.5 代謝組學數據分析原始數據經ProteoWizard軟件轉成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，用自建二級質譜數據庫匹配進行物質注釋。使用SIMCA軟件（V16.0.2）進行多元統計分析，主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）等方法進行分析。通過OPLS-DA模型篩選出VIP>1且P<0.05 的差異性代謝物。

2.6 統計分析使用SPSS 20 軟件進行統計學分析。采用t檢驗(Student's t-test)比較組間差異，P<0.05認為差異有統計學意義，用斯皮爾曼相關分析進行統計學分析。

3 結果

3.1 大鼠生長狀態YC組大鼠皮毛濃密、光滑有光澤，行動靈敏。C組大鼠毛色粗糙、稀松暗淡，少動。較C組大鼠相比，FH和FL組大鼠反應較為靈敏。

3.2 代謝組學方法學驗證QC樣本在PCA-X一維分布圖（圖1A-B），QC樣品全部位于±2 STD之內，說明本次實驗數據質量較好。

3.3 多元統計分析本實驗采用正、負離子模式對4組大鼠尿液樣品的代謝輪廓進行比較分析，大鼠尿液QC樣本正、負離子模式總離子流圖見圖2，QC樣品的聚集性好，檢測系統相對穩定，總離子流圖輪廓總體相似。

圖1 大鼠尿液QC樣本在PCA-X一維分布圖

圖2 大鼠尿液的QC樣本總離子流圖

經PCA處理得到的得分圖能直觀地顯示出不同干預條件下各組研究對象代謝輪廓的變化，樣本的聚集代表具有相似的代謝組分，處于相似的生理狀態。圖3A-B分別是正、負離子模式下各組大鼠尿液PCA得分圖，由圖可見實驗處理90 d后，根據大鼠年齡和干預條件的不同各組樣本間呈現明顯的分離趨勢，表明各組大鼠體內的小分子代謝產物發生了變化。為進一步建立各組間的特異性差異模型，采用OPLS-DA分析方法對各組大鼠尿液代謝組學數據展開模式識別，OPLS-DA分析方法能夠更大程度的體現兩組樣本的聚集性和分離性。見圖3C-D，證明衰老組、青年組和法薏苡仁高劑量組大鼠尿液中代謝產物的變化。

為避免過度擬合，本研究進行7倍交互驗證和置換檢驗（n=200），結果顯示模型具有較好的穩定性且不存在過擬合現象。見圖3E-F。以上結果表明，本研究建立的模型有效且可用于模型差異標志物的篩選。

圖3 大鼠尿液正離子模式PCA圖（A）、負離子模式PCA圖（B）；YC組與C組，OPLS-DA圖（C），OPLS-DA置換檢驗圖（R2Y：0.993，Q2：0.797）（E）；C組與FH組，OPLS-DA圖（D），OPLS-DA置換檢驗圖（R2Y：1，Q2：0.971）（F）

3.4 衰老模型組與青年對照組大鼠尿液生物標志物篩選與YC組相比，C組大鼠尿液正、負離子模式共鑒定出5個生物標志物，L-犬尿氨酸、硫酸脫氫表雄酮、N8-乙酰亞精胺、花生四烯酸和對甲酚。見表1。

表1 大鼠尿液衰老生物標志物

3.5 衰老模型組與法薏苡仁給藥組大鼠尿液生物標志物篩選與衰老模型組相比，FH組大鼠尿液正、負離子模式下共鑒定出5個生物標記物，N8-乙酰亞精胺、熊去氧膽酸、吲哚乙酸、皮質酮、和對甲酚。見表2。

表2 大鼠尿液法薏苡仁生物標志物

3.6 年齡與衰老相關生物標志物相關性分析運用斯皮爾曼相關系數分析年齡與L-犬尿氨酸和對甲酚呈極顯著正相關（P<0.01），與硫酸脫氫表雄酮、N8-乙酰亞精胺和花生四烯酸呈顯著負相關（P<0.05）。見表3。對甲酚、熊去氧膽酸和對甲酚之間呈極顯著正相關（P<0.01）。見表4。

表3 年齡與衰老生物標志物的相關性分析

表4 對甲酚、吲哚乙酸和熊去氧膽酸間相關性分析

4 討論

本實驗基于代謝組學技術共篩選出5種衰老相關生物標志物，通過生物學功能分析，均能較好地反應衰老人群機體的代謝特征。吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）是催化色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶，其在免疫抑制和自身免疫中的具有重要作用。IDO活性的增強可使L-色氨酸的分解代謝增強進而使血清L-犬尿氨酸水平的升高，（本實驗結果衰老組尿L-犬尿氨酸水平升高）。Ladomersky E等［9］發現與青年人相比老年人腦中IDO mRNA表達顯著增加，并與外周血中循環免疫抑制樹突狀細胞比率正相關，提出了IDO抑制老年人機體免疫功能的假說。本實驗研究發現，C組較YC組大鼠尿液中L-犬尿氨酸相對含量顯著升高，相關性分析顯示年齡與L-犬尿氨酸呈極顯著正相關（P<0.01），驗證了這一假說。

前列腺素等二十碳衍生物對人體心血管系統及免疫系統具有十分重要的作用。作為這類生物活性物質的直接前體，花生四烯酸具有酯化膽固醇、增加血管彈性、降低血液粘度，調節血細胞功能等一系列生理活性，對預防心血管疾病、糖尿病和腫瘤等具有重要功效［10-11］。本實驗研究發現，衰老大鼠尿液中花生四烯酸相對含量顯著降低，相關性分析顯示年齡與花生四烯酸呈顯著負相關（P<0.05），推測衰老大鼠機體可能因花生四烯酸代謝異常導致免疫系統受損。

硫酸脫氫表雄酮（DHEA-S）是類固醇激素生物合成中重要的中間產物，是脫氫表雄酮（DHEA）在體內的游離形式，其隨循環系統到達相應靶組織，進而轉化成雄激素和雌激素發揮其生物學作用。Chehab Olfa等［12］通過觀察突尼斯老年人群DHEA-S與年齡的關系，發現隨著年齡的增長，C-19類固醇激素的分泌（DHEA和DHEA-S）下降。本實驗結果顯示，DHEA-S隨年齡的增長而降低（P<0.05），相關性分析顯示年齡與DHEA-S呈顯著負相關（P<0.05），實驗結果符合老年人群代謝變化。

N8乙酰亞精胺（N8-AcSpd）是亞精胺乙酰化衍生物，在細胞生長和分化發揮重要作用。Stefania等定量分析了長壽、老年和青年/成年健康獻血者全血中亞精胺含量，長壽和青年/成年組亞精胺水平顯著高于老年組，且長壽和青年/成年組亞精胺的水平相當。健康人體尿液中的多胺水平與年齡有關，隨著年齡的增長逐漸減少［13-15］。本次實驗中，C組較YC組大鼠尿液N8-AcSpd水平顯著降低，相關性分析顯示年齡與N8-AcSpd呈顯著負相關（P<0.05）。有學者認為，通過攝入富含亞精胺的食物、增加體內亞精胺的生物合成，或者增加腸道中合成亞精胺的益生菌活性等方式，將老年人體內下降的亞精胺水平恢復到年輕個體的生理水平可能是更可行的延緩衰老的有效途徑［16-17］。本實驗發現FH、FL組較C組大鼠尿液中N8-AcSpd水平顯著提高（P<0.01），推測法薏苡仁可通過某種途徑提高體內N8-AcSpd的水平逆轉衰老機體的代謝變化。

對甲酚是腸道菌群代謝色氨酸的代謝產物，其在體內的含量主要受飲食影響，健康人群高蛋白飲食可使對甲酚血清含量升高。有研究發現［18］，健康人群隨著年齡的的增長對甲酚體內含量升高。本實驗結果顯示，與YC組比較，C組大鼠尿液中對甲酚含量顯著升高（P<0.01），相關性分析顯示年齡與對甲酚呈極顯著正相關（P<0.01），與衰老人群機體代謝變化一致。與C組相比，FH和FL組大鼠尿液中對甲酚含量顯著下降（P<0.01），具有劑量-效應關系，其變化趨勢向YC組變化。吲哚乙酸是色氨酸在腸道分解的代謝產物，主要由腸道益生菌：生孢梭菌和消化鏈球菌代謝產生，其可促進腸上皮屏障保護功能，并能顯著降低免疫細胞的炎癥反應［19］。本實驗結果顯示，與C組比較，FH和FL組大鼠尿液中吲哚乙酸的含量顯著下降（P<0.01）。由此推測法薏苡仁可能主要通過改變腸道菌群分布，影響色氨酸的代謝，進而改變對甲酚在體內的含量，同時增加體內吲哚乙酸的生物利用度，降低由機體衰老導致的腸道炎癥反應，改善衰老機體的代謝環境。

隨著年齡的增長或在各種條件刺激下，機體內將會大量產生活性氧（ROS）和/或活性氮（RNS），發生氧化應激，如不能被及時清除，將有助于腸道疾病的發生。熊去氧膽酸（UDCA）具有抗氧化，抗凋亡和抗自噬的作用，可阻斷促谷胱甘肽耗竭藥物對機體造成的損傷［20-21］。本實驗中FH組較C組大鼠尿液中，熊去氧膽酸含量顯著下降（P<0.01），推測法薏苡仁可能通過增加UDCA的利用率，加強衰老大鼠腸道抗氧化作用。通過相關性分析發現，對甲酚、吲哚乙酸和熊去氧膽酸具有極顯著的正相關（r>0.6，P<0.01），三者之間變化具有協同性，可能在代謝過程中處于較為接近的反應步驟。由此推斷，法薏苡仁可能通過降低腸道炎癥反應和抗氧化作用發揮抗衰老的作用。

5 結論

通過非靶向代謝組學分析，發現退役雌性大鼠機體5種衰老的生物標志物，生物學功能分析發現該衰老動物模型能較好地反應衰老人群機體的代謝特征。法薏苡仁可通過逆轉衰老相關標志物N8-AcSpd和對甲酚在體內的變化改善衰老機體的代謝環境。