人工設計短肽對α-淀粉酶催化作用的影響

魯明杰，李傳博，謝丹丹，遲乃玉，岳松年，竇少華*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

淀粉酶能夠催化α-1,4糖苷鍵水解，并將淀粉分解為多種重要的物質，如單糖、糊精等[1-3]。它主要從微生物來源生產，分為α，β和γ亞型，應用十分廣泛，約占世界酶市場的25%～30%，在食品、制藥和洗滌等工業生產領域中起著至關重要的作用[4-6]。

影響淀粉酶活性的因素有很多，包括溫度、pH、酶濃度、底物濃度、激活劑和抑制劑等[7-8]。目前，通過生物學科和物理學科相結合來提高淀粉酶的生產水平成為科學研究重點。經常采用的技術手段是通過電場裝置向酶解體系中直接加入高頻、中頻和低頻電場以達到改變淀粉酶活性的目的[9]。Zeta電位被認為是一種估計蛋白表面電位的間接工具，是維持最佳蛋白功能的關鍵物理特性[10-11]。因此，可以選擇Zeta電位作為判定蛋白表面由于各種過程而發生的變化的工具。

電場可以使氨基酸表面的正負電荷產生高頻率交替位移，從而使酶活性降低、升高。α-淀粉酶活性升高可以加速底物的分解，提高發酵工業效率；α-淀粉酶活性降低，可以有效延長淀粉制品的保質期[12]。毛霉蛋白酶經過高頻電場處理后，酶活增長幅度較大，有的甚至高達20%[13]。中等頻率電場處理果膠甲酯酶后，發現在0.4 V/cm電場強度下對果膠甲基酯酶活性具有顯著效果[14]。低頻電場輻射條件下生長的釀酒酵母縮短了生長遲滯期，加快了其對數生長期，且其生長速率相比自然生長提高了14.5%[15]。由此可知，高頻和低頻電場可以直接作用在酶上，作用快，效果顯著，但是也有弊端，如能耗大，不夠環保。如果能夠人工合成和電場具有相同作用的短肽，則可以有效解決這個問題。

人工設計短肽可以依據實際需求，利用不同氨基酸帶電性的不同，合成總電荷量不同的短肽[16]。鄧真真等[17]以經典米氏動力學方程為基礎，構建復雜體系中酶促反應動力學模型，從理論以及實驗角度來全面地對體系中底物的豐度與其相應酶促速率之間的關系進行研究，證明復雜體系中的酶解反應速率幾乎與底物的豐度無關。本課題組劉榮娜等[18]通過測定米氏常數（Km）和活化能（Ea）驗證了帶電蛋白質的加入可以提高酶與底物的親和力，增加酶的催化效率。因此，以結構清晰的牛血清白蛋白氨基酸序列為模板，人工設計合成帶有正電荷和負電荷的兩條短肽T8-和T9+。本研究將T8-和T9+兩條短肽加入α-淀粉酶酶促反應，并對α-淀粉酶和帶電荷短肽反應過程各種因素進行科學分析，在最優測定條件下研究人工設計帶電荷短肽的加入對淀粉酶催化作用的影響，可以為酶的食品、醫藥、農業應用等研究提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NaH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、HCl、NaOH、NaCl、可溶性淀粉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；α-淀粉酶（500～1 500 U/mg）：美國Sigma-Aldrich公司；4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）、1-羥基苯并三唑（hydroxybenzotrizole，Hobt）、N,N'-二異丙基碳二亞胺（N,N'-diisopropylcarbodiimide，DIC）、wang樹脂、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、巴豆酸：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海一恒儀器有限公司；Multiskan GO全波長酶標儀：賽默飛世爾科技公司；Zeta電位儀：Brookhaven Instruments Inc.。

1.3 方法

1.3.1α-淀粉酶活性的測定

采用3,5-二硝基水楊酸測定還原糖[19-20]計算α-淀粉酶活力。α-淀粉酶活力計算公式如下：

式中：C為標準曲線上查得的葡萄糖含量，μmol；Ew為0.2 mL酶

液中含有的酶的質量，mg；t為反應時間，min。

α-淀粉酶活定義：將pH值為6.9，溫度為40 ℃時，每分鐘水解淀粉產生1.0 mg的葡萄糖所需要的α-淀粉酶量定義為一個酶活力單位（U/mg）。

1.3.2α-淀粉酶最適反應條件的優化

溫度對α-淀粉酶活力的影響：分別設置實驗溫度（30℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃），加入200 μL 10-4g/mL的α-淀粉酶溶液，磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffersaline，PBS）濃度0.01mol/L，緩沖液pH 6.9，測定α-淀粉酶的活力。

PBS緩沖液濃度對α-淀粉酶活力的影響：分別設置PBS緩沖液濃度（0、0.01 mol/L、0.02 mol/L、0.03 mol/L、0.05 mol/L、0.10 mol/L），加入200 μL 10-4g/mL的α-淀粉酶溶液，設置溫度40 ℃，緩沖液pH 6.9，測定α-淀粉酶的活力。

緩沖液pH對α-淀粉酶活力的影響：分別設置緩沖液pH（6.5、6.7、6.9、7.0、7.1、7.3、7.5），加入200 μL 10-4g/mL的α-淀粉酶溶液，設置溫度40 ℃，PBS緩沖液濃度0.01 mol/L，測定α-淀粉酶的活力。

1.3.3 短肽的合成

根據氨基酸的帶電性，利用多肽技術合成路線合成直線肽T8-、T9+[16，21]。

合成路線：樹脂溶脹→連接首個氨基酸→脫保護→檢測（深藍色為陽性反應）→第一次清洗→縮合→第二次清洗→檢測（無色為陽性反應）→肽鏈的延伸→肽的收縮→氨基酸側鏈脫保護→樹脂的切割→粗品肽

1.3.4 高效液相色譜分析

分別對兩條短肽進行高效液相色譜測定，分析其純度，色譜條件參考文獻[22]。

1.3.5 T8-和T9+對α-淀粉酶活力的影響

先將α-淀粉酶溶液稀釋為10-4g/mL，再分別加入200 μL 1 mg/mL T8-、T9+溶液，作用5 min，再按照1.3.1方法測得酶活，考察酶活變化。

依次稀釋T8-、T9+溶液濃度為10-4U/mg，10-5U/mg，10-6U/mg，10-7U/mg，10-8U/mg，取溶液200 μL加入α-淀粉酶溶液中，作用5 min，再按照1.3.1方法測得酶活，考察酶活變化。

1.3.6 米氏常數的測定

將含量為2%的淀粉溶液依次稀釋至0.25%、0.50%、1.00%和1.50%的底物濃度。分別將200 μL T8-溶液和T9+溶液加入200 μLα-淀粉酶溶液，40 ℃水浴反應5 min，測得還原糖的產量。按照底物濃度和反應速率的關系使用雙倒數法作圖[21，23]，可得到最大反應速率（Vm）和米氏常數（Km）。

1.3.7 活化能的測定

酶能夠明顯的降低反應所需活化能，從而加快反應速度。溫度對反應速度的影響，一般表現為隨著溫度的升高，化學反應也隨之加快，服從Arrhenius公式[24-25]。分別在30 ℃（303 K）和40 ℃（313 K）條件下測量各自的酶促反應速率常數。

式中：K為酶促反應速率常數；R為摩爾氣體常數；T為熱力學

絕對溫度，K；Ea為活化能，J/mol；A為阿倫尼烏斯常數。

（1）根據直線求Ea以為X軸，log K為Y軸，依據四點數據，求出回歸方程Y=aX+b，最小二乘積計算出斜率a，將R值代入計算得Ea。

（2）依據兩點數據直接計算法，選擇在30 ℃（303 K）和40 ℃（313 K）條件下測量各自的酶促反應速率常數K，Ea計算公式為：

1.3.8 Zeta電位的測定

分別將1.4 mLα-淀粉酶溶液、T8-溶液、T9+溶液、淀粉溶液、水加入到Zeta電位樣品池中，測得電位[26-27]。然后將α-淀粉酶溶液：T8-溶液、α-淀粉酶溶液：T9+溶液按1∶1比例混合，依次加入到Zeta電位樣品池中，測得電位。最后將α-淀粉酶溶液：T8-溶液：淀粉溶液、α-淀粉酶溶液：T9+溶液：淀粉溶液按1∶1∶1比例混合，依次加入到Zeta電位樣品池中，測得電位。

1.3.9 統計分析

利用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.0.0軟件對試驗數據進行統計與分析。實驗數據均進行3次平行，以平均值±標準偏差表示。數據分析過程中，當P＜0.05，表示具有顯著性差異，顯著性的置信區間為95%。

2 結果與分析

2.1 最適測定條件的優化

不同濃度緩沖液、pH、溫度對α-淀粉酶酶活影響見圖1。

圖1 不同溫度（A）、濃度緩沖液（B）、pH值（C）對α-淀粉酶酶活影響Fig.1 Effect of different temperature (A),buffer concentrations (B),and pH (C) on α-amylase activities

由圖1A可知，隨著溫度的升高，α-淀粉酶的活性呈先增加后降低趨勢，在溫度為40 ℃時，α-淀粉酶酶活有最大值，為199.66 U/mg，說明α-淀粉酶的最佳測定溫度為40 ℃。溫度為30～45 ℃時酶活雖然有變化，但是變化并不大，說明在適宜溫度范圍內，溫度對α-淀粉酶酶活有影響，但影響不大。

由圖1B可知，隨著緩沖液濃度的增加，α-淀粉酶的活性呈不斷降低趨勢，在緩沖液濃度0.01 mol/L時，α-淀粉酶酶活有最大值，為628.12 U/mg，說明α-淀粉酶的最佳緩沖液濃度為0.01 mol/L。

由圖1C可知，隨著緩沖液pH的增加，α-淀粉酶的活性呈先增加后降低趨勢，在pH值為6.9時，α-淀粉酶酶活有最大值，為626.12 U/mg，說明α-淀粉酶的最佳緩沖液pH值為6.9，α-淀粉酶酶活受pH值影響較大，后續實驗應充分注意pH的影響。

2.2 短肽合成結果

人工設計合成的帶電荷短肽T9+和T8-的高效液相色譜圖見圖2，分析結果見表1、表2。

表1 T9+高效液相色譜分析結果Table 1 Analysis results of high performance liquid chromatography of T9+

表2 T8-高效液相色譜分析結果Table 2 Analysis results of high performance liquid chromatography of T8-

圖2 T9+（A）及T8-（B）的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of T9+(A) and T8-(B)

結果表明，制備的短肽T9+RKHYRQSTEFKKVHQ通過高效液相色譜儀檢測后出現四個峰，有三種微量雜質，可忽略不計，第三個峰為短肽T9+，純度為98.04%，分子質量為1 972.26，溶解性正常，符合所需實驗要求。制備的短肽T8-YEDEFHNDQEYSETD通過高效液相色譜儀檢測后出現兩個峰，第二個峰為短肽T8-，純度為98.88%，分子質量為1 920.85，溶解性正常，符合所需實驗要求。

2.3 T8-和T9+對α-淀粉酶作用的影響

2.3.1α-淀粉酶活力

不同種類及濃度短肽對淀粉酶活力的影響見圖3。由圖3可知，短肽T8-和T9+質量濃度為10-4g/mL時，加入T8-后，α-淀粉酶酶活為314.27 U/mg，與空白組（未加入短肽）酶活304.72 U/mg相比增加3.13%，加入T9+后，α-淀粉酶酶活為300.58 U/mg，與空白組酶活相比降低1.36%。說明帶不同種電荷的短肽對α-淀粉酶酶活有相反的作用，且隨著加入T8-和T9+溶液濃度的減小，α-淀粉酶酶活變化的趨勢減小，在短肽質量濃度為10-4g/mL時酶活影響最大，可能是由于所帶電荷的不同引起α-淀粉酶酶活發生不同的變化?？傮w來講，人工設計帶負電荷短肽T8-對α-淀粉酶的催化作用有正效應，人工設計帶正電荷短肽T9+對α-淀粉酶的催化作用有負效應。

圖3 不同種類及濃度短肽加入對酶活的影響Fig.3 Effects of adding different kinds and concentrations of short peptides on enzyme activity

2.3.2 米氏常數的測定

反應速率由不同底物濃度下所產生的還原糖含量可求得，依據雙倒數作圖法，做出加入不同短肽后α-淀粉酶的米氏方程曲線，得到的α-淀粉酶的反應動力學參數見表3。

表3 加入不同短肽溶液的α-淀粉酶動力學參數Table 3 Kinetic parameters of α-amylase with different short peptides

由表3可知，加入T8-溶液，米氏常數Km升高，Vm/Km增加；加入T9+溶液，米氏常數Km值降低，Vm/Km也增加，說明不同帶電荷短肽的加入使酶與底物的親和力發生改變[23]。

2.3.3 活化能的測定

反應速率與活化能密切相關[8]，不同種類及濃度短肽對活化能的影響見圖4。由圖4可知，加入T8-和T9+后酶的活化能有明顯的改變。加入T8-后，活化能從原來的2 152.89 J/mol降低為497.44 J/mol，活化能降低，酶活升高，說明T8-起到提高酶活性的效果。加入T9+后，活化能為4 942.90 J/mol，增加130%，說明T9+起到降低酶活性的效果。其中，質量濃度為10-5g/mL時，活化能改變最小，質量濃度為10-6g/mL時，活化能改變最大，其余質量濃度短肽對活化能的影響也非常明顯。說明不同質量濃度T8-和T9+的加入對活化能分別起到降低和升高活化能的作用，且影響較大。

圖4 不同種類及濃度短肽加入對活化能的影響Fig.4 Effects of adding different kinds and concentrations of shortpeptides on activation energy

2.3.4 電位變化

T8-、T9+、酶、底物淀粉溶液按比例加入后搖勻，進行電位測定，結果見表4。由表4可知，將T8-和T9+加入到酶和底物淀粉體系后，原有體系電位值分別增加了32%和47%，說明T8-和T9+的加入，影響了α-淀粉酶的酶促反應，從而影響了Zeta電位，也說明可將電位的變化作為觀察酶性質的一個指標。

表4 不同物質的Zeta電位Table 4 Zeta potential of different substances

續表

3 結論

本實驗利用多肽固相合成法合成帶電荷短肽T8-和T9+，并探討其對α-淀粉酶的活性、米氏常數（Km）、活化能和Zeta電位的影響。T8-使α-淀粉酶體系活化能降低，反應易發生，可作為激活劑應用在食品發酵中提高發酵速率。T9+使α-淀粉酶體系活化能升高，反應難發生，可作為抑制劑應用在食品貯藏中延遲腐敗速率。人工設計的短肽，結構簡單，組分單一，能耗小成本低，危害性低，將其應用在食品生產、發酵、釀造以及紡織工業具有極大的創新意義和應用價值。因此，可以進一步驗證酶與底物的催化作用和短肽表面所帶電荷的相關性，為增加或降低酶的活化能提供有力支撐。