響應面法優化桂花酒釀造工藝

張陽陽，侯賀麗，王榮榮，李建芳，郝晨暉

（信陽農林學院 食品學院，河南 信陽 464000）

桂花是信陽市的市花，含有多種重要的生物活性物質，其中黃酮類、多酚類等活性物質含量很高，且對人體內各種自由基有一定抑制作用[1-4]。桂花酒歷史悠久，古人認為桂為百藥之長，用桂花來釀酒可以達到“飲之壽千歲”的功效，該酒香甜醇厚，有開胃醒神、健脾補虛的功效[5-7]。桂花酒對女士特別適用，被贊譽為“婦女幸福酒”[8]。目前對于桂花酒的研究主要集中在浸提制取工藝、香氣成分分析與抗氧化研究等方面，如黃夢明等[9]對新型桂花酒的浸提工藝進行研究及抗氧化評價，結果表明浸提工藝生產的新型桂花酒，總黃酮提取率可達到91.34%，并具有較強的抗氧化能力；楊淇等[10]研究了桂花酒的制備與其香氣成分分析，結果表明以浸泡法制備的桂花酒，香氣成分檢測出24種可揮發性成分，香氣濃郁，但在發酵桂花酒方面研究較少。

因此本試驗以信陽本地的大米和桂花為原料，以黃酒發酵工藝為基礎制作桂花酒并對其工藝進行優化，擬開發一種新型發酵型桂花酒。首先利用植物乳桿菌（Lactobacil-lus plantarum）對大米進行酸化，其次以安琪酵母和麥曲共同發酵消除生物胺對酒口感和飲后舒適度的不良影響，以期提高酯類物質使酒更加綿柔，提高其營養價值[11-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：信陽香絲苗米；桂花：信陽農林學院校園桂花自采自曬；安琪耐高糖高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌凍干粉（食品級）：鄭州百益生物技術有限公司；麥曲：老河口市任家米酒黃酒加工廠；無水乙醇（體積分數98%）：鄭州派尼化學試劑廠；冰乙酸（分析純）：天津市巴斯夫化工有限公司；亞鐵氰化鉀（分析純）：鄭州派尼化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

LDZM-80L-Ⅲ立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；ZHJH-C1112C超凈工作臺：上海分析儀器制造有限公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；SPX-150-BS-Ⅱ生化培養箱：北京中興偉業世紀儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 桂花酒發酵工藝流程及操作要點

操作要點：

大米預處理：選取優良大米，清洗后置于容器中，加入植物乳桿菌于培養箱中進行生酸，在漿水pH降至4.2左右，即可停止發酵[14-17]。

植物乳桿菌按0.1%（以干米500 g為基準）添加，在18 ℃培養至pH值達4.2左右停止，確定浸米時間，以縮短傳統浸泡浸米時間。

蒸飯：處理后的大米淘洗干凈放到鍋中蒸70～90 min，蒸至無夾心、不沾粘、顆粒（較）松散。

淋飯、冷卻：用預先準備好的冷卻水少量多次對其進行降溫，冷卻至30 ℃左右。

糖漬桂花：干桂花放入質量濃度為1 g/100 mL的鹽水中浸泡5 min，然后控干水分。再大火蒸10 min。將等質量的冰糖（食品級）加適量的水熬制成糖漿，將桂花倒入進行翻拌。冷卻后裝罐并用蜂蜜封頂，放入冰箱冷藏7 d后使用。

接種：麥曲粉碎，將干米質量2%～6%的麥曲及0.2%的酵母菌一同拌入米中，搭窩后，在其表面撒入2%～6%糖漬桂花[8，13，18]。

前發酵：糖化24 h后進行翻拌，72 h后加入50%干米質量的冷卻水，發酵結束的前24 h加入40%干米質量的冷卻水，開始密封產醇，12 h后再加入40%干米質量的冷卻水，共計加入130%干米質量的冷卻水[8]，然后進行過濾。

后發酵：撒入少量2%糖漬桂花，以增加酒中桂花的色、香、味，然后轉入18 ℃條件下發酵72 h[15]。

壓榨：用四層紗布過濾出酒體，裝入滅菌玻璃罐中。

澄清：將盛有酒的玻璃罐密封保存，并置于陰涼干燥處放置24 h。

煎酒：將盛有酒的玻璃罐用保鮮膜密封好，放入水浴鍋中加熱至90 ℃，并保溫20 min，即得桂花酒成品。

1.3.2 桂花酒發酵工藝優化單因素試驗

以干米500 g為基準，固定酵母添加量0.2%，以感官評價和酒精度為評價指標，在麥曲添加量為0.4%，發酵溫度25 ℃，發酵時間192 h條件下考察糖漬桂花添加量（2%、3%、4%、5%、6%）對桂花酒品質的影響；在糖漬桂花添加量4%，麥曲添加量0.4%，發酵時間192 h條件下考察發酵溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）對桂花酒品質的影響；在糖漬桂花添加量4%，麥曲添加量0.4%，發酵溫度25 ℃，探究發酵時間（144 h、168 h、192 h、216 h、240 h）對桂花酒品質的影響；在糖漬桂花添加量為4%，發酵溫度25 ℃，發酵時間192 h，探究麥曲添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）對桂花酒品質影響。

1.3.3 桂花酒發酵工藝優化響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，使用Box-Behnken中心原理設計試驗，以糖漬桂花添加量（A）、麥曲添加量（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）為4個因素，桂花酒酒精度（Y1）和感官評分（Y2）為響應值，設計4因素3水平響應面試驗考察各因素交互作用對桂花酒酒精度和感官評分的影響，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 桂花酒發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of Osmanthus fragrans wine

1.3.4 測定方法

pH值：pH計測定；還原糖：按照GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》中直接滴定法測定[19]；酒精度：按照GB/T 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》中酒精計法測定[20]；總酸：按照GB 12456—2021《食品中總酸的測定》中酸堿指示劑滴定法[21]。

感官評定：邀請10位具有食品專業背景人員，參照GB/T 27588—2011《露酒》的標準對發酵桂花酒進行感官評分（總分100分），取10人的平均分[22]，感官評分標準見表2。

表2 桂花酒的感官評分標準Table 2 Sensory score criteria of Osmanthus fragrans wine

續表

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌干預對浸米時間的影響

浸米是黃酒制作的前端工藝，將此程序應用于桂花酒中，加快了大米的酸化過程，使大米膨脹，蒸煮縮短了工藝時間，而且降低桂花酒中的生物胺含量，提高飲后舒適感[17]。在浸泡大米的過程中，添加植物乳桿菌，其菌種快速繁殖以達到生酸，在漿水pH降至4.2左右，即可停止發酵[18]。由圖1可知，在18 ℃條件下，當浸米時間60 h時漿水pH值接近4.2。因此，確定浸米的最佳時間是60 h。

圖1 植物乳桿菌干預對浸米時間的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum intervention on rice soaking time

2.2 桂花酒發酵工藝優化單因素試驗結果

2.2.1 糖漬桂花添加量對桂花酒品質的影響

由圖2可知，桂花酒酒精度、感官評分隨糖漬桂花添加量的增加呈先升高后降低的趨勢，糖漬桂花添加量為4%時桂花酒酒精度最高，為13.8% vol，此時感官評分為73.1分；糖漬桂花添加量為5%時桂花酒感官評分最高，為75.1分，此時酒精度為12.9% vol。當糖漬桂花添加量＜4%時，可發酵糖量減少，桂花酒的酒精度和感官評分均較低；當添加量＞4%時，可發酵糖量較多，酵母菌營養豐富迅速生長同時也快速衰亡[23]，致使酒精度和感官評分較低。因此，確定糖漬桂花添加量4%為最佳添加量。

2.2.2 麥曲添加量對桂花酒品質的影響

由圖3可知，桂花酒酒精度和感官評分隨著麥曲添加量的增加呈先升高后又略降低的趨勢。在麥曲添加量為0.4%時桂花酒感官評分、酒精度均最高，分別為74.9分、13.7% vol。當麥曲添加量＜0.4%時，麥曲添加較少易被雜菌污染而發生變質，當添加量＞0.4%時，麥曲中的根霉菌快速生長而發生衰亡，使酒的苦味較明顯[24]。因此，確定麥曲添加量0.4%為最佳添加量。

圖3 麥曲添加量對桂花酒品質的影響Fig.3 Effects of wheat malt addition on the quality of Osmanthus fragrans wine

2.2.3 發酵溫度對桂花酒品質的影響

由圖4可知，桂花酒酒精度和感官評分隨著發酵溫度的升高呈先升高后又略降低的趨勢。在發酵溫度為30 ℃時桂花酒感官評分、酒精度均最高，分別為77.5分、14.8% vol。當發酵溫度低于30 ℃時，發酵進行緩慢，且易被雜菌污染、滋味不協調；當發酵溫度高于30 ℃時，高溫致使麥曲（中高溫曲）中的根霉菌和毛霉菌易成為優勢菌，要及時進行攪拌、散溫，否則會發酵失敗[25]。因此，確定發酵溫度30 ℃為最佳發酵溫度。

圖4 發酵溫度對桂花酒品質的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of O.fragrans wine

2.2.4 發酵時間對桂花酒品質的影響

由圖5可知，桂花酒酒精度和感官評分隨著發酵時間的延長呈先升高后又略降低的趨勢。在發酵時間為192 h時桂花酒感官評分、酒精度均最高，分別為76.4分、14.7% vol，當發酵時間＜192 h時，發酵時間過短，發酵不充分、酒香不明顯、顏色淺黃渾濁暗淡；當發酵時間＞192 h后，發酵時間過長，酒精開始部分轉化為其他醇類、酯類、有機酸等，使酒精度降低[26]，影響口感。因此，確定發酵時間192 h為最佳發酵時間。

圖5 發酵時間對桂花酒品質的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the quality of Osmanthus fragrans wine

2.3 桂花酒發酵條件優化響應面試驗結果與分析

由表3、表4可知，Y2模型中各因素交互作用均不顯著，因此只對酒精度（Y1）進行分析。4個因素經過擬合后得酒精度（Y1）的二次多元回歸方程為：Y1=15.48+0.50A+0.29B+0.19C+0.32D+0.025AB-0.100AC+0.33AD+0.37BC-0.13BD+0.20CD-0.69A2-0.38B2-0.65C2-0.84D2。由表5可知，Y1的回歸方程模型顯著（P＜0.000 1），失擬項P=0.076 6＞0.05不顯著，表示模型與試驗結果擬合度較好；決定系數R2=0.993 2，調整決定系數R2Adj=0.9863，表明酒精度的實際值與預測值之間的擬合度較高[27-28]。4個因素對酒精度的影響順序：糖漬桂花添加量＞發酵時間＞麥曲添加量＞發酵溫度。從分析中還可以看出，一次項A、B、C、D，交互項AD、BC、CD，二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項AC和BD對結果影響顯著（P＜0.05）。

表3 桂花酒發酵條件優化響應面試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of response surface tests for fermentation conditions optimization of Osmanthus fragrans wine

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression mode

2.4 各因素交互作用的響應面分析

使用Design-Expert 8.0.6軟件處理數據，得出糖漬桂花添加量、麥曲添加量、發酵溫度及發酵時間交互作用對桂花酒酒精度影響的響應曲面和等高線，結果如圖6所示。由圖6可知，等高線呈橢圓形，說明糖漬桂花添加量和發酵溫度、糖漬桂花添加量和發酵時間、麥曲添加量和發酵溫度、麥曲添加量和發酵時間、發酵溫度和發酵時間存在交互作用，與表4方差分析結果一致。

由圖6可知，隨著A（糖漬桂花添加量）和C（發酵溫度）的增加酒精度呈現先增后減的趨勢，A對應的曲面坡度相較于C的陡峭，即A對酒精度的影響程度大于C，等高線呈橢圓形，表示A和C交互作用顯著；隨著A（糖漬桂花添加量）和D（發酵時間）的增加酒精度呈現先增后減的趨勢，A對應的曲面坡度相較于D的陡峭，即A對酒精度的影響程度大于D，等高線呈橢圓形，表示糖漬A和D交互作用極顯著（P＜0.01）；隨著B（麥曲添加量）和C（發酵溫度）的增加酒精度呈現先增后減的趨勢，C對應的曲面坡度相較于B的陡峭，即C對酒精度的影響程度大于B，等高線呈橢圓形，表示B和C交互作用極顯著（P＜0.01）；隨著B（麥曲添加量）和D（發酵時間）的增加酒精度呈現先增后減的趨勢，D對應的曲面坡度相較于B的陡峭，即D對酒精度的影響程度大于B，等高線呈橢圓形，表示B和D交互作用顯著（P＜0.05）；隨著C（發酵溫度）和D（發酵時間）的增加酒精度呈現先增后減的趨勢，D對應的曲面坡度相較于C的陡峭，即D對酒精度的影響程度大于C，等高線呈橢圓形，表示C和D交互作用極顯著（P＜0.01）。

圖6 各因素交互作用對桂花酒酒精度影響的響應曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on alcohol content of Osmanthus fragrans wine

最終得到最優工藝參數：生酸過程為植物乳桿菌添加量0.1%，18 ℃條件下發酵60 h；發酵過程為糖漬桂花添加量5%，麥曲添加量0.3%，固定酵母添加量0.2%，發酵溫度30 ℃，發酵時間192 h。

2.5 模型驗證

為了驗證模型具有可行性，用得到的最佳工藝參數進行驗證試驗，3次平行試驗得到桂花酒酒精度為14.61% vol，感官評分達到81.9分。酒精度與預測值（14.50% vol）相對誤差為0.007 8，模型不顯著（P＞0.05），模型驗證成功，桂花酒品質工藝優化是可行的，得到的工藝參數具有實際應用價值。最后測得成品桂花酒糖度（以葡萄糖計）為23 g/L，酸度（以乳酸計）為3.6 g/L，口感清爽，酒體金黃透亮。

3 結論

本試驗得出的桂花酒最佳工藝，即選擇自制優質干桂花，先制作成糖漬桂花，添加0.1%植物乳桿菌，大米進行酸化，添加0.2%酵母、5%糖漬桂花、0.3%麥曲，在30 ℃發酵192 h，然后過濾，即可得到感官評分81.9分，酒精度為14.61% vol，糖度為23 g/L（以葡萄糖計），酸度3.6 g/L（以乳酸計）的桂花酒。桂花酒有著濃郁的桂花香氣，諸香和諧純正，口感清爽，酒體呈金黃透亮。

傳統黃酒生產工藝，在發酵前期加入了新鮮桂花，使得酒精度介于12% vol～13% vol，糖度（以葡萄糖計）45～50 g/L，總酸（以乳酸計）4.5～6.5 g/L。本試驗的結果中酒精度較高，糖度較低，酸度較低，口感清爽，酒液清亮，如何將酒精度降低至12% vol～13% vol、提升殘糖還有待進一步研究，在積極改善桂花酒的口感的同時且不失營養功效，在降低成本的同時提高附加值，為桂花酒的研究提供了一定的基礎，且有益于本地經濟發展。