全煙氣對細胞抗氧化能力的影響

陳利平，張東鵬，黃紫琪，田君瑞，王夢圓，韓亞偉?

（1. 鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；2. 河南中煙工業有限責任公司駐馬店卷煙廠，河南 駐馬店 463000）

卷煙煙氣是一種復雜的混合物，化學物質種類繁多，其中大部分具有毒性作用，本實驗室利用活體小鼠探索建立了體內安全評價方法[1]，獲得了很好的實驗效果。后續的研究中發現這些煙氣成分中一部分具有氧化性，當組織或細胞受到全煙氣暴露時，機體內的氧化-抗氧化平衡被破壞，細胞會表現出氧化應激與炎癥反應，并且引發機理性損傷。研究發現，當細胞出現氧化應激反應時，胞內的活性氧族（ROS）以及活性氮族（RON）的活性增加，對脂質、蛋白質和遺傳物質等造成不同程度的氧化損傷[2]。活性氧是指機體內或大自然中由氧組成，含氧并且性質活潑的物質的總稱，在正常的生命過程中，活性氧維持在一個正常水平，具有一定的免疫和信號轉導功能，是機體的有效防御系統，但是在一定條件下，由于產生和清除的活性氧失去了正常平衡，通常會導致活性氧對機體的損傷。細胞遭受到氧化損傷后，會激活胞內的抗氧化防御系統[3]。機體存在的抗自由基抗氧化兩大防御體系：一類是酶性防御體系，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）等。另一類是非酶性防御體系，包括谷胱甘肽（GSH）、維生素E、維生素C等[4-5]。本文選取暴露時長1 h組，以SOD、活性氧（ROS）、CAT、GSH-Px、總抗氧化能力（T-AOC）為指標，通過對細胞進行卷煙全煙氣暴露處理，研究全煙氣對細胞抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

V79細胞株：中科院上海細胞資源中心；GSH-PX測試試劑、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試試劑盒、CAT測試試劑盒、蛋白定量測試試劑盒、T-AOC檢測試劑盒、ROS測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Heraeus Pico 17 高速常溫離心機、NanoDrop2000微量紫外分光光度計：Thermo Scientific；QL-902漩渦混合器：江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；JS-680B水浴鍋：上海培清科技有限公司；F-7000熒光分光光度計：日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養技術

將V79細胞接種于含有10%胎牛血清（FBS）的高糖培養基DMEM中，在25 cm2的一次性培養瓶中培養，培養箱設置的環境為溫度37 ℃、二氧化碳濃度為 5%、濕度為 95%。生長良好的細胞呈單層貼壁生長，每2～3 d需要傳代一次，細胞生長到占瓶底約90%時進行傳代，一般選取對數生長期的細胞用于實驗將細胞懸液用細胞計數儀測定濃度，加培養基調整至實驗需要的濃度，設置空白組、實驗組和對照組，每組6個重復，每孔 100 uL。需要在接種細胞的孔周圍加注100 uLPBS緩沖液，以防邊緣實驗孔的培養基在培養箱中蒸發，影響實驗結果。

1.3.2 細胞全煙氣暴露

1.3.2.1 將細胞接種至微孔膜 取微孔膜一張，光滑面朝上放入培養皿中，加入 1 mLDMEM 培養基，浸潤20 min；將傳代后的細胞在37 ℃，二氧化碳濃度5%，95%濕度的環境下培養48 h。倒出培養基，用 2 mL PBS清洗兩次，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后，向培養瓶中加入 3 mLDMEM培養基吹散，向放有微孔膜的培養皿中加入1 mL細胞懸液，靜置10～20 min，小心轉移至二氧化碳培養箱中培養。24 h后換液，換液時，將培養皿傾斜，用移液槍緩慢吸出舊培養基，再緩慢加入 2 mL新培養基，然后放入二氧化碳培養箱，再培養24 h待用。

1.3.2.2 細胞全煙氣暴露處理 將接種有細胞的微孔膜放入全煙氣暴露模型中，實驗組通入煙氣，對照組通入純凈空氣，對細胞進行暴露處理。其中，實驗組設置0.5、1、1.5 h三個時間組，每個時間組設置3個濃度組，分別為4支煙/h、6支煙/h、8支煙/h，每支煙的整個燃吸過程大約持續5 min，均勻的分布于整個暴露過程，其余的時間通如等流量的純凈空氣。稀釋程度按煙氣 60%，空氣 40%。每個時間組設置一個對照，對細胞進行同時長同流量的暴露處理。

1.3.3 細胞ROS含量檢測

采用DCF法檢測全煙氣暴露后，用試劑盒檢測細胞內的ROS水平[6-7]。

將DCFH-DA配制成濃度為20 μM的溶液，避光放置。取新的培養皿，將全煙氣暴露處理后細胞連同微孔膜一起放置于培養皿中，將 1 mL DCFH-DA的培養基溶液加入培養皿，放入二氧化碳培養基孵育1 h。

將培養基小心吸棄，加入1 mL的0.25%胰酶消化 2 min 后，再直接加入 1 mL PBS，輕輕吹打，使微孔膜上的細胞脫落下來，收集細胞懸液轉移至 2 mL 離心管，1 000 r/min 離心 7 min。

將上清吸棄，用2 mL PBS清洗2次，離心收集細胞沉淀。

用PBS將細胞沉淀重懸，調整至1×106個/mL，上熒光分光光度計，激發波長490 nm，發射波長530 nm測吸光度。

1.3.4 細胞破碎

首先將細胞用胰酶消化下來，接著收集細胞懸液，然后 1 000 G 離心 7 min，棄上清。用 PBS小心清洗兩次，再次離心，用PBS重懸。本實驗中，把PBS重懸后細胞懸液濃度全部調整為1×105個/mL。取0.7 mL細胞懸液轉移至2 mL的離心管中，將離心管放入液氮中冷凍30 s，取出后放入冰水混合物中解凍10 min，如此反復凍融3次，所得細胞破碎液可直接用于檢測。

1.3.5 全煙氣暴露后細胞的蛋白濃度測定

使用蛋白定量測試盒測定待測細胞的蛋白濃度。

1.3.6 全煙氣暴露后細胞的T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性檢測

使用南京建成生物工程研究所的試劑盒，檢測待測細胞的 SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC活性，并根據說明所給的公式計算結果。實驗進行三次重復，取平均值，并計算偏差。

1.4 數據分析

試驗數據均采用平行試驗的平均值，試驗結果用 Microsoft Office Excel 2016 對其進行分析。

2 結果與分析

2.1 全煙氣暴露處理對V79細胞內ROS水平的影響

在真核細胞的有氧呼吸過程中，有一部分氧沒有被完全還原，生成具有較強氧化作用的ROS，包括羥自由基過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子、（HO-）等[8]。正常條件下，生命過程中所產生的活性氧會維持在一個正常的水平，本身具有一定的免疫以及信號轉導功能，屬于機體有效防御系統的一部分，但是過多的活性氧會對細胞和機體造成損傷，由于性質活潑，它會與蛋白質、核酸和脂肪發生反應，破壞這些物質的結構，擾亂細胞的正常功能[9-10]。

實驗分別對各組細胞進行一小時的空氣暴露和4、6、8支煙/h濃度的煙氣暴露處理，然后用熒光分光光度計分別檢測各組的吸光度。結果顯示，同時長條件下，V79細胞內的ROS水平隨著煙氣濃度的提高而上升，各濃度組與對照組比較皆有顯著性差異（P<0.05）。當全煙氣濃度為8支煙/h，細胞內的ROS水平為對照組的近2.5倍，說明全煙氣對V79細胞內的ROS水平影響很大，V79細胞內的ROS水平迅速升高，是細胞大量死亡的原因之一。結果見圖1。

圖1 全煙氣暴露處理后細胞內ROS相對含量Fig.1 Relative content of ROS in cells after whole smoke exposure treatment

2.2 全煙氣暴露處理對V79細胞內SOD活力的影響

SOD是機體對抗氧自由基的酶促防御體系中重要的組成部分。SOD能催化機體內的超氧化物歧化反應，在抗氧化酶中處于至關重要的地位。在活性氧清除系統里，它是抗氧化酶中第一個發揮作用的[11]。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基（O2-）保護細胞免受損傷[12]。因此，細胞內的SOD的含量能夠反映細胞的抗氧化能力。本試驗中，對V79細胞進行全煙氣暴露后，4支煙/h濃度下，細胞內的SOD活性較對照組略有提升，而隨著煙氣濃度的增加，細胞內的 SOD活性明顯降低,詳見表1，圖2。SOD是已知的機體中，目前惟一能夠特異性地清除體內超氧自由基的抗氧化酶，SOD可以把機體內過量的超氧自由基歧化成過氧化氫，然后在過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的催化作用下轉化為水，防止細胞被自由基傷害[13]。實驗結果表明，低劑量的煙氣刺激下，SOD活性出現了短暫的提升，來消除細胞因煙氣刺激產生的過量活性氧。而隨著煙氣劑量的增高，SOD會因消除自由基造成自身的損耗，這直接反映于細胞內SOD活性的降低，細胞對超氧化物的還原能力也隨之弱化，無法抵御煙氣刺激對細胞的損傷。

表1 全煙氣對V79細胞SOD活性的影響Table 1 Effect of whole smoke on SOD activity of V79 cells

圖2 全煙氣對V79細胞SOD的影響結果圖Fig.2 Results of the effect of whole smoke on V79 cell SOD

2.3 全煙氣暴露處理對 V79細胞內GSH-PX活力的影響

谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）廣泛存在于機體內的一種重要的催化過氧化氫分解的酶。對于單個細胞，細胞膜的完整性是保持細胞內環境穩定，保障各項生理活動有序進行的重要基礎[14]。每當細胞受到外援化合物的攻擊時，細胞膜是最先受到損傷的，而細胞膜損傷會導致膜內物質的外逸，致使細胞死亡。在細胞的生命活動中，當機體出現過量的自由基時，超氧自由基被SOD歧化成H2O2，然后在GSH-PX和過氧化氫酶的催化作用下，將其轉化為水，從而達到保護機體的目的。對于經煙氣暴露的 V79細胞，同時間下，GSH-PX的活力隨著煙氣濃度的升高而降低，結果具有顯著性（P<0.05），詳見表2，圖3。結果說明，全煙氣可能會抑制細胞內GSH-PX的活性，同時，為了清除細胞內由煙氣刺激產生的過量自由基，也消耗了不少GSH-PX，造成機體內抗氧化能力的降低。

表2 全煙氣對V79細胞GSH-PX活性的影響Table 2 Effect of whole smoke on GSH-PX activity of V79 cells

圖3 全煙氣對V79細胞GSH-PX活力的影響結果圖Fig.3 Effect of whole smoke on the vitality of GSH-PX in V79 cells

2.4 全煙氣暴露處理對V79細胞內CAT活力的影響

CAT是一類末端氧化酶，是生物防御系統中的關鍵酶之一[15]。CAT在細胞中與GSH-PX一起清除代謝產生的過氧化氫，使細胞免受過氧化物的毒害[16]。本實驗中，經煙氣暴露處理的V79細胞中，CAT的活力值隨著煙氣濃度的升高而降低。實驗進行3次重復，結果具有顯著性（P<0.05），詳見表3，圖4。

表3 全煙氣對V79細胞CAT活性的影響Table 3 Effect of whole smoke on the activity of V79 cell CAT

圖4 全煙氣對V79細胞CAT活力的影響結果圖Fig.4 The effect of whole smoke on the vitality of V79 cell CAT

2.5 全煙氣暴露處理對V79細胞內T-AOC活力的影響

目前的研究中，T-AOC是常用來反映機體抗氧化功能情況的一個重要的綜合性指標，它可以顯示機體中非酶促系統以及抗氧化酶系統應對外來刺激的代償能力和機體內自由基的代謝情況[17]。T-AOC衡量機體具有的總的抗氧化能力，當檢測到機體T-AOC活力顯著降低時，說明機體內的抗氧化系統受到了大量消耗，間接反映了機體內有過量的自由基產生，這在研究機體是否受到氧化損傷時，是某些特定的單項抗氧化劑指標所無法替代的[18-19]。本實驗中，當V79細胞受到1 h不同濃度的煙氣暴露后，T-AOC活力較對照組顯著下降（P<0.05），詳見表4，圖5。而且隨著濃度的增加，T-AOC的活性下降的更快，這說明煙氣使得細胞整體的抗氧化能力下降，細胞內的自由基無法及時被清除，對細胞造成了一定的氧化損傷。

表4 全煙氣對V79細胞T-AOC活性的影響Table 4 Effect of whole smoke on the activity of T-AOC in V79 cells

圖5 全煙氣對V79細胞T-AOC活力的影響結果圖Fig.5 The effect of whole smoke on the vitality of V79 cell T-AOC

3 結論

通過對 V79細胞進行1 h不同濃度4、6、8支煙/h的全煙氣暴露，選取 ROS、SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC為指標，研究全煙氣對細胞抗氧化能力的影響。結果表明，全煙氣會對細胞內的抗氧化物質產生消耗和抑制，導致胞內的活性氧自由基含量增加，抑制的效果隨煙氣濃度的增加而愈加顯著。過量的活性氧會導致細胞的氧化損傷，導致細胞死亡。