糧油食品防霉微生物篩選及其活性物質初步研究

郭 超，韓 偉，任 菲，王 超?

（國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

根據FAO估計，每年至少有2%的糧食因霉變而不能食用。我國糧食每年因霉變造成的損失占總產量的 1.5%～3%[1]。真菌及其真菌毒素污染是威脅糧食儲藏運輸流通環節安全、造成糧食損失的主要因素之一，許多真菌能引起糧食變色、發熱，同時產生大量的真菌毒素。我國每年因真菌及真菌毒素污染造成的糧食減產、浪費和安全風險，不僅使得國民的身體健康受到威脅，還直接影響我國的糧油食品安全[2-4]。目前解決糧食霉變的途徑可分為物理、化學、生物三類。物理方法主要包括氣調儲藏、低溫儲藏、微波以及納米氧化鋅、納米銀等的吸附作用；化學方法主要是利用丙酸、山梨酸、雙乙酸鈉、苯甲酸等酸類物質及其鹽[1,5-7]。生物學方法主要有利用生物來源的具有防霉功能的活性物質，如香辛料、中草藥等植物中提取的精油，具有抑菌性能的活性物質主要為醛類、酚類、酯類和醇類[8-10]；來源于動物的殼聚糖、魚精蛋白等[11-12]；目前見報道的產生防霉活性物質的微生物主要有鏈霉菌屬（Streptomyces)、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas putida）、根霉屬（Rhizopus）、木霉屬（Trichoderma）等[7]。

芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）于 1945年即被發現其代謝物具有抑菌活性[13]，因具有穩定性好、抗逆性高、抑菌譜廣等優點，其產生的大量抗菌化合物已應用于食品加工和作物保護領域，如食品防腐劑、治療劑和生物農藥[14]。有效成分包含芽孢桿菌的防霉菌劑產品有普濾仕日本九州的日本鬼粉、湖北省武漢天惠公司的枯草芽孢桿菌、山東泰諾藥業的木霉菌蠟質芽孢桿菌泰諾-維克等[7]。枯草芽孢桿菌類成員包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）等。其產生的抑菌物質根據其生物合成途徑和化學性質可區分為非核糖體途徑合成的脂肽類抗菌肽、核糖體途徑合成的蛋白類抗菌物質以及揮發性化合物[15-17]。

本研究以禾谷鐮刀菌（F. graminearum）為指示菌，篩選產防霉活性物質微生物，得到防霉活性較高的7株芽孢桿菌，初步確定活性物質為肽類，本研究結果為新型防霉劑開發提供了菌株來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

待篩菌種及常見指示霉菌：國家糧食和物資儲備局科學研究院篩選和保藏。

1.1.2 培養基

肉湯培養基（LB培養基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，115 ℃滅菌 25 min；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA固體培養基）：馬鈴薯浸出粉 10 g/L，葡萄糖 20 g/L，121 ℃滅菌 25 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養

菌株活化：菌株接種于 LB液體培養基，接種量1‰，30 ℃、200 r/min震蕩培養。

菌株培養：活化培養24 h后接種于LB液體培養基，接種量 1‰，30 ℃、200 r/min 震蕩培養。

1.2.2 防霉活性篩選

禾谷鐮刀菌菌塊放置于PDA固體平板中間，30 ℃培養24 h。平板上等距離放置3～4個圓形濾紙片，濾紙片滴加10 μL待測樣品后30 ℃培養。平板培養48～72 h后，采取十字交叉法測定抑菌圈直徑。以抑菌圈直徑大于30 mm判定為防霉效果強，以抑菌圈直徑處于20～30 mm之間判定為防霉效果中等，以抑菌圈直徑處于10～20 mm之間判定為防霉效果弱，以抑菌圈直徑小于10 mm判定為沒有抑菌效果。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態觀察 LB平板上劃線分單菌落，觀察單菌落形態；取菌液制片，10×100倍鏡下觀察顯微形態。

1.2.3.2 生化反應鑒定 采用梅里埃芽孢桿菌鑒定試劑盒進行生化反應鑒定。

1.2.3.3 16S rDNA 基因序列比對 測序結果由美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站進行Blast比對，再使用MEGA5.1軟件，采取鄰接法（Neighbor-Joining法）構建系統發育樹，可靠性檢驗bootstrap法。

1.2.4 抑菌譜的測定

采用打孔法，指示菌禾谷鐮刀菌菌塊放置于平板中間，30 ℃培養24 h，其余霉菌（灰綠曲霉Aspergullus glaucus、黃曲霉A. flavus、亮白曲霉Aspergillus candidus、黑曲霉A. nige、赭曲霉A.ochraceus、青霉Penicilliumsp.和產黃青霉P.Chrysogenum）調整孢子液濃度約為107cfu/mL后吸取 100 μL 涂布于打孔平板上。將菌液 4 000 r/min離心10 min，向孔中加入100 μL上清液后靜置，直至上清液被吸收，30 ℃培養。平板培養48～72 h后，測量抑菌圈直徑。

1.2.5 培養時間對防霉活性的影響

菌株按照方法1.2.1進行培養，不同時間段取樣測量 OD600吸光度值并以禾谷鐮刀菌為指示菌，查看抑菌效果。

1.2.6 活性物質分析

菌株按照方法1.2.1培養后，離心取上清液分別進行熱處理、蛋白酶K處理及耐酸堿性實驗，采用打孔法查看防霉效果，指示菌選用禾谷鐮刀菌。熱處理：在2 mL離心管中加入1 mL上清液，于50、75和100 ℃處理60 min，對照為未經處理的上清液；蛋白酶K處理：在2 mL離心管中加入900 μL上清液和100 μL 10 mg/mL蛋白酶 K，37 ℃處理60 min，對照為未經處理的上清液和以同樣方法處理的蛋白酶K；耐酸堿性：取10 mL上清液分別調節 pH至 2、4、6、10、12，30 ℃靜置 1 h 后 4 000 r/min 離心 10 min，取上清液調節pH至8.6，用0.22 μm濾器過濾，對照為未調節pH的過膜上清液。

1.3 數據分析

數據處理采用 Origin 2018、Mega5.1、Excel等軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌株防霉效果篩選

對菌種庫中自酸菜、青貯飼料、老面饅頭、玉米種植田地土壤等環境分離保存的364株細菌進行防霉效果篩選（見表1）。由表1可知，近50%的菌株具有防霉活性，其中抑菌圈直徑大于20 mm的菌株占 38.47%。將初篩防霉活性強的 33株菌進行復篩驗證后選取活性較高且穩定的7株菌，編號分別為 ASAG 62、ASAG 112、ASAG 2ME6、ASAG 2MF8、ASAG 2MD10、ASAG M6 和 ASAG M9。

2.2 菌種鑒定

所選菌株在LB平板上培養24 h后菌落形態如圖1所示。ASAG 62菌落直徑2 mm左右，菌落整體表面光滑，凸起；ASAG 112菌落較小，直徑1～1.5 mm左右，邊緣不規則，整個菌落表面有褶皺狀凸起；ASAG M6、ASAG M9和 ASAG 2MD10形態相近，菌落直徑2～3 mm，邊緣清晰光滑，邊緣有環狀凸起，環狀凸起中間凹陷；ASAG 2MF8菌落直徑2～3 mm，邊緣不規則，表面不光滑有黏液，菌落中間有少許褶皺狀凸起；ASAG 2ME6菌落直徑1～1.5 mm，中間有凸起，表面不光滑有黏液。在10×100倍下觀察7株菌均為短桿菌。

圖1 菌落形態（A）和顯微形態（10×100倍，B）Fig.1 Colony morphology (A) and microscopic morphology (10×100 times, B)

采用梅里埃芽孢桿菌鑒定試劑盒對 7株菌進行生化反應鑒定，部分結果如表2所示。7株菌的%ID接近100，T值大于0.4，有意義的分類單位均被歸類為枯草/解淀粉芽孢桿菌。區別主要集中于能否利用D-木糖、D-蜜二糖、D-棉子糖、淀粉與糖原。

表2 生化反應鑒定結果Table 2 Identification results of biochemical reactions

為進一步確定種屬，將7株菌16s rDNA序列經 Blast比對。結果顯示，其與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）、暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）、解淀粉芽孢桿菌等芽孢桿菌屬菌株Query covery達到 99%以上。選取芽孢桿菌屬模式菌株構建系統發育樹，結果顯示，該 7株益生菌與貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌在同一分支上，與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌也具有極高的親緣性（見圖2）。貝萊斯芽孢桿菌因與解淀粉芽孢桿菌具有極高的相似性而被認為是解淀粉芽孢桿菌的同物異名，于2016年由Dunlap等[16]認定其在細菌命名法中的分類地位。暹羅芽孢桿菌又譯為西姆芽孢桿菌，于2010年被收錄為有效種名[17]。

圖2 菌株與芽孢桿菌屬模式菌株16S rDNA基因系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of the screening strains and type strains of Bacillus sp.

2.3 培養時間對防霉活性的影響

通過繪制生長曲線可知：7株菌在培養 17 h后進入對數期，29～41 h時菌株濃度達到最大值，其中 ASAG 62、ASAG 112、ASAG M6和 ASAG 2MD10生長較快，菌株濃度于培養29 h達到最大值且 OD600均高于 3.0；ASAG M9、ASAG 2ME6、ASAG 2MF8 相對緩慢，培養 41 h OD600最高，其中ASAG 2ME6與ASAG 2MF8菌株濃度相對較小，OD600低于 2.5（圖3A）。以禾谷鐮刀菌為指示菌，測定不同培養時間菌液上清的抑菌效果，發現進入對數期后抑菌效果顯著增加，而菌株濃度達到最大值后，抑菌效果基本保持穩定，因此采用培養48 h的發酵液進行防霉實驗（圖3B）。

圖3 培養時間對防霉活性的影響Fig.3 Effect of culture time on bacteriostasis of F. graminearum

2.4 菌株對糧油食品中常見霉菌的抑菌效果

取 7株高防霉活性菌株上清液采用打孔法對8種糧食中常見霉菌進行防霉實驗，如表3所示。7株菌的活性物質對亮白曲霉和禾谷鐮刀菌抑制效果最顯著，能夠完全抑制亮白曲霉的生長；ASAG 2MD10對青霉、禾谷鐮刀菌的抑制效果最好，抑菌直徑分別為19.0 mm和35.0 mm；ASAG 62對產黃青霉、黑曲霉、赭曲霉、黃曲霉抑制效果最好，對黃黃曲霉的抑菌直徑為15 mm；ASAG 2ME6對灰綠曲霉抑制效果最好。

表3 篩選菌株對常見霉菌的抑制效果Table 3 Inhibition effect of screening strains on common molds mm

2.5 防霉活性物質初步分析

貝萊斯芽孢桿菌與暹羅芽孢桿菌均為枯草芽孢桿菌的近緣種，同樣具有廣譜抗菌性和高穩定性，主要抗菌活性物質為非核糖體合成的脂肽類抗生素[18-19]。通過對篩選所得7株菌上清液進行蛋白酶K處理后其防霉效果基本沒有變化，而對照蛋白酶 K溶液對禾谷鐮刀菌完全沒有抑菌效果；進行不同溫度處理發現100 ℃高溫處理使防霉活性明顯降低甚至消失，說明活性物質在高溫下不穩定；經測定發現上清液pH位于8.4～8.8之間，酸性環境下上清液產生沉淀，離心后調節pH至8.6，通過防霉實驗發現在pH6～10之間除ASAG 112外其它6株菌具有防霉活性，初始pH條件下防霉活性最高，酸堿度影響防霉活性，初步推測其活性物質為肽類物質（見圖4）。

圖4 蛋白酶K、溫度及pH對防霉活性的影響Fig.4 Effect of different treatment (A Proteinase K, B Temperature, C pH) on anti-mold activity

3 結論

本研究通過對大量菌株進行篩選得到7株防霉活性較強的菌株，均與貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌具有較近的親緣關系，初步歸屬為芽孢桿菌屬。繪制生長曲線并測定不同時間上清液的抑菌活性，確定培養時間為48 h。活性物質不易被蛋白酶K分解，不耐高溫，耐受pH范圍為6～10，初步分析為肽類物質。其中ASAG 62對常見霉菌，尤其是高毒霉菌黃曲霉具有一定抑菌活性。下一步擬對 ASAG 62、ASAG 2MD10 和 ASAG 2ME6菌株進行發酵液的復配研究，進一步提高防霉效果、擴大抑菌譜，尋找新的推廣途徑。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網（http://lyspkj.ijournal.cn）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。