一株抗小麥赤霉病菌的白蓮蒿內生真菌的篩選及代謝產物質譜分析

陳紅娟，莊緒會，鄒海杰，李光濤，韓 偉，苗海江，杜傳林，羅曉宏?

（國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

小麥赤霉病是禾谷鐮刀菌引發的真菌性病害[1]，嚴重威脅我國小麥的安全生產和糧食安全，而生物防治是一種綠色高效且相對安全的防治措施，契合農業可持續發展的要求，近年來逐漸受到重視。本研究旨在從藥用植物內生菌中篩選出小麥赤霉病拮抗菌，為植物生防提供理論依據。藥用植物白蓮蒿，系菊科蒿屬植物，除高寒地區外，廣泛分布于我國各地，具有清熱、解毒、涼血止血等藥理活性[2]。目前關于白蓮蒿研究多集中在倍半萜內酯、薁類、揮發油等化學成分[3-5]和保肝、抗炎、抗過敏、殺螨[6-9]等藥理學研究。然而，有關其內生真菌及其次生代謝產物研究較少，截止目前還未見有關白蓮蒿內生真菌及次生代謝產物的相關報道。微生物次生代謝產物是天然產物庫的重要組成部分，是新型治療藥物先導化合物開發的重要源泉[10]，本文首次報道了該植物內生菌分離，純化，抗糧食病原菌禾谷鐮刀菌的活性和質譜分析代謝產物，旨在為醫藥生產、植物病蟲害生物防治和綠色農藥的研究提供有價值菌種資源和活性物質。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

活性測試菌種（小麥赤霉病菌），編號113713：科研物資采購平臺；

白蓮蒿，采摘時間2019年11月5日：北京西山國家森林公園（北緯 39°57′59″，東經 116°11′29″，海拔 214.1 m）；

色譜乙腈：默克股份兩合公司；色譜甲酸：西格瑪中國上海貿易有限公司；去離子水，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

R-100旋轉蒸發儀：瑞士步琦有限公司；CJ-10超凈工作臺：天津市泰斯特儀器有限公司；XS105電子天平：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；TS-211B恒溫搖床：常州中誠儀器制造有限公司；LDZF-75L-III高壓滅菌鍋：海申安醫療器械廠；MJX-50霉菌培養箱：紹興蘇珀儀器有限公司；Ultimate 3000&Q Exactive HF LC-MS：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基配制

PDB培養基配方：1 000 mL蒸餾水后加入馬鈴薯塊200 g，煮沸30 min，三層紗布過濾后，濾渣繼續用水稀釋，最終補水值1 000 mL，再加葡萄糖20 g趁熱攪拌溶解，最后分裝三角瓶中，于121 ℃蒸汽滅菌 20 min。所有菌種培養均采用PDA培養基。

1.3.2 植物內生菌分離、純化

取新鮮白蓮蒿用自來水沖洗干凈，曬干水分后，用滅菌刀片將根、莖、葉切成0.5×1 cm的小段，葉切成0.5×0.5 cm的方塊狀，用75%消毒酒精浸泡1 min后，無菌水洗3次，轉移至無菌超凈臺，用無菌紙擦干表面水分后移入PDA培養基中分離培養。28 ℃下培養5 d，采用尖端菌絲挑取法[11]，取邊緣新長出的菌絲，及時轉移至新鮮PDA培養基上培養，觀察記錄菌落的形態和做編號，同時要做無菌對照。

1.3.3 內生真菌代謝產物的制備和提取

對培養好的內生真菌打5 mm的菌餅，接種于 600 mL PD液體培養基的三角瓶（3個菌餅/瓶），于 26 ℃，140 r/min搖床培養 20 d，分離菌絲和發酵液，菌絲乙酸乙酯浸泡，提取浸膏；發酵液無菌過濾于冰箱4 ℃保存備用。

1.3.4 內生真菌代謝產物抑菌活性測試

各菌株抑菌活性測定采用菌絲生長速率法[12]，以供試植物病原菌為檢測菌，測定白蓮蒿內生菌發酵液中活性代謝產物的抑菌作用，將無菌發酵液2、18 mL冷卻到45 ℃左右PDA培養基混勻，倒入9 cm無菌培養皿中，待凝固后將供試病原真菌菌餅（5 mm）倒置于平板中央，每處理三次重復，以 PDA培養液和無菌水處理為對照。培養72 h后，用十字交叉法測量供試菌落生長直徑，取其平均值，計算抑制率。

1.3.5 液/質譜分析

樣品前處理：將發酵液10 000 r/min離心5 min，過濾，V（甲醇）∶V（濾液）=1∶1，取混合液過0.22 μm無菌濾膜。

色譜條件：Zorbax Eclipse C18色譜柱（1.8 μm*2.1*100 mm）；柱溫為 30 ℃；流速 0.3 mL/min；流動相組成A：（水+0.1%甲酸），B：純乙腈；進樣量為 2 μL，自動進樣器溫度 4 ℃，流速為0.3 mL/min；采用梯度洗脫。

質譜條件：正模式：加熱器溫度325 ℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；吹掃氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.5 KV；毛細管溫度：330 ℃；S-Lens RF Level：55%。掃描模式：一級全掃描（Full Scan，m/z 100～1 500）與數據依賴性二級質譜掃描（dd-MS2，TopN=10）；分辨率：120 000（一級質譜）& 60 000（二級質譜）。碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD）。

1.4 數據分析

使用WPS軟件整理數據和繪圖。

2 結果與分析

2.1 活性菌株篩選

將從白蓮蒿內生菌中優選的8株內生菌并進行活性測試，研究發現菌株（No：20202707）發酵液對禾谷鐮刀菌抑制率最好，抑制率達到65.27%（表1）。選擇該菌株為測試菌株。

表1 白蓮蒿內生真菌來源及拮抗效果Table 1 Sources of endophytic fungi from Artemisia Sacrorum Ledeb and antagonistic effects %

續表1

2.2 植物內生菌鑒定

將純化好內生菌接種PDA培養基，25 ℃培養7 d，菌落長滿全皿，白色，質地絲絨狀；反面淺黃色；無滲出液產生，無可溶性色素產生（圖1）。菌絲壁平滑、透明，具分隔；分生孢子梗分枝明顯；瓶梗單生或2～3個輪生，長12～30 μm；分生孢子梭形或橢圓形，兩端尖細，大小（5～15）×（2.5～4.5）μm，壁平滑；未見大分生孢子（圖2）。將該菌測試序列與NCBI的Gen Bank數據庫中的已知序列進行比對，取相似度較高的序列，利用MEGA 5.0軟件和鄰位連接法（neighbor-joining methods）構建系統發育樹（圖3）。結合菌株的形態學特征和系統發育樹分析，菌株（No：20202707）鑒定為 Fusarium redolens。

圖1 宏觀形態Fig.1 Macro morphology

圖2 微觀形態Fig.2 Micro morphology

圖3 內生真菌（No：20202707）的TIS的序列系統發育樹Fig.3 Sequence phylogenetic tree of TIS of endophytic fungi (No: 20202707)

2.3 質譜分析

使用 Compound Discoverer 3.1 進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、等工作，根據二級質譜信息利用 Thermo mzCloud在線數據庫，Thermo mzValut本地數據庫等，對內生菌株（No：20202707）發酵液進行物質鑒定，分析結果（表2），代謝產物共有178個，經鑒定結構類型產物有43種。菌株Fusarium redolens代謝產物在陽離子模式下總離子流圖（圖4）。

表2 白蓮蒿內生菌（No：20202707）代謝物定性分析結果Table 2 Qualitative analysis results of MS from metabolites of endophytic fungi (No: 20202707) from Artemisia Sacrorum Ledeb

圖4 菌株Fusarium redolens代謝產物在陽離子模式下總離子流圖Fig.4 Complete ion chromatogram of extracts of Fusarium redolens in positive ion mode

3 結論

本文首次分離報道了白蓮蒿內生真菌的代謝產物抗菌活性和分析主要代謝產物，通過生長速率法測試研究發現，白蓮蒿內生真菌（No：20202707）對小麥赤霉病病原菌禾谷鐮刀菌的抑菌作用最強，抑菌率在65.27%，經鑒定該菌株為芳香鐮刀菌真菌；并利用液質聯用技術和Compound Discoverer 3.1數據處理軟件和結合數據庫，研究其代謝產物結構信息，該菌株具有豐富代謝產物，主要有3,4-二氫香豆素、5′脫氧核糖核苷、Harmala生物堿、苯并呋喃和苯并噻唑等43種類別。另外，發現菌株具有很好抗小麥赤霉病活性，是開展生物防治理想菌株，可做為新型綠色農藥來源之一，為高效、低毒的新型抗糧食病原菌藥物的開發利用提供理論指導和物質基礎。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網（http:// lyspkj.ijournal.cn）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。