火龍果莖多糖提取方法比較

李國(guó)勝 白新鵬

(海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心 海南海口 570228)

火龍果屬仙人掌科（Cactaceae）多年生攀緣植物，又名紅龍果、青龍果、仙蜜果等［1］。火龍果莖富含多種礦物質(zhì)、植物甾醇、植物多糖、維生素E 以及黃酮類化合物等［2］，果莖中膳食纖維、黃酮類化合物含量豐富，是保健食品的重要加工原料。在多種化學(xué)成分中植物多糖的含量較高，達(dá)到7%左右［3］。火龍果莖具有生長(zhǎng)迅速、分枝能力較強(qiáng)等特點(diǎn)，在火龍果種植過程中，為加快其生長(zhǎng)并保持果實(shí)品質(zhì)，一般僅保留一條主莖，需要不斷修剪分枝，產(chǎn)生了大量廢莖，可以作為火龍果莖多糖提取資源，變廢為寶［4］。

多糖的提取方法主要有內(nèi)部沸騰法、酶提法、微波輔助法、超聲波輔助法、熱水浸提法及超高壓提取法等［5-8］。熱水提取法相比其它方法更簡(jiǎn)便快捷、提取率高，為工業(yè)化提取火龍果莖多糖提供了新途徑［9］。馬若影等［10］研究表明，利用亞臨界水提取法來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最佳提取條件為提取溫度140℃，提取時(shí)間25 min，料液比1∶50（g/mL）。超聲波輔助法的原理是對(duì)植物細(xì)胞壁造成破壞，主要是采用機(jī)械效應(yīng)以及超聲波的空化對(duì)植物的細(xì)胞壁造成影響，這樣可以使細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的溶出效率大大提升，進(jìn)而可以加快提取的速度［11］。目前我國(guó)對(duì)火龍果莖的研究報(bào)道比較少，火龍果莖加工產(chǎn)業(yè)幾乎還處于空白階段，因此火龍果莖的開發(fā)前景非常廣闊。該研究以火龍果莖為原材料，分別使用熱水提取法、亞臨界水提取法及超聲波輔助法來提取火龍果莖多糖，并對(duì)影響多糖提取率的各種因素進(jìn)行相關(guān)分析；同時(shí)對(duì)不同方法制得的多糖樣品進(jìn)行色澤、中性糖含量、紅外光譜等理化指標(biāo)對(duì)比，綜合比較3種方法制取多糖的優(yōu)劣，為火龍果莖的綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

紅心火龍果莖由海南省東方市北緯十八度果業(yè)有限公司于2019年6月提供。

1.1.2 試劑

葡萄糖（A.R.）、濃硫酸（A.R.）、苯酚（A.R.）、鹽酸（A.R.）、廣州化學(xué)試劑廠，無水乙醇（A.R.）西隴科學(xué)股份有限公司。

1.1.3 儀器

FDU-2100 型冷凍干燥機(jī)（上海愛朗儀器有限公司），F(xiàn)W-177 型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），GL-20G-Ⅱ型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），HT-250FC型亞臨界水提取裝置（上海霍桐實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），752-N 型可見紫外分光光度計(jì)（上海精密儀器科學(xué)有限公司），EV-321 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司），KQ-800KDE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

1.2.1.1 熱水提取法

將火龍果莖粉碎，過40目篩，得到固體粉末，稱量2 g 加入提取瓶，混合一定比例蒸餾水并攪拌，熱水提取一定時(shí)間，離心取上清液濃縮，醇沉，離心分離，冷凍干燥得多糖粗品。

1.2.1.2 亞臨界水提取法

火龍果莖干燥后粉碎，濕潤(rùn)吸水，加適量水并調(diào)節(jié)pH，在一定溫度和時(shí)間下進(jìn)行提取，提取液離心分離，取上清液濃縮，醇沉靜置24 h，離心分離，冷凍干燥得粗多糖。

1.2.1.3 超聲輔助提取法

將紅心火龍果莖粉碎、過40目篩、得到粉末，稱量2 g，加入蒸餾水，均勻攪拌，進(jìn)行超聲輔助提取，超聲處理考慮條件為：超聲時(shí)間、處理功率、提取溫度、料液比。離心，濃縮，混合乙醇（95%），低溫240 min 進(jìn)行醇沉。離心分離，洗滌，冷凍干燥，得多糖粗品。

1.2.2 火龍果莖多糖的測(cè)定

準(zhǔn)備火龍果莖多糖5 mg，加水定容到50 mL，該溶液的濃度為0.1 mg/mL，然后對(duì)其進(jìn)行吸光度的測(cè)定，利用葡萄糖溶液獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再代入吸光度計(jì)算得到火龍果莖多糖的含量。

火龍果莖多糖提取率＝［（C×V）/W］×100%

式中，C為樣品溶液中多糖濃度（mg/mL），V為樣品溶液體積（mL），W為火龍果莖粉質(zhì)量（mg）。

1.2.3 色澤判定

肉眼觀察，對(duì)色澤進(jìn)行描述并記錄。

1.2.4 中性糖含量測(cè)定

用硫酸-苯酚法［11］得到多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝48.557 1X＋0.006 1，R2＝0.993 7。移取 2 mg/mL多糖供試液10 mL，加入5 mL 5%十六烷基三甲基溴化銨溶液，攪拌均勻后，40℃靜置5 h，離心，取上清液定容到50 mL，得到中性多糖供試液。準(zhǔn)確量取0.1 mL 中性多糖供試液，混合1.0 mL 5.0%苯酚溶液，緩慢加入5.0 mL 濃硫酸，混勻，沸水浴15 min左右，靜置至室溫，在490 nm最大吸收峰處測(cè)定其吸光度，得出含量。

1.2.5 紅外光譜分析

取用不同方法制得的干燥火龍果莖多糖樣品約2 mg與溴化鉀粉末約200 mg，于瑪瑙研缽中，在干燥的情況下混勻，研磨均勻后置于壓片機(jī)內(nèi)壓制成片，采用傅里葉光譜儀TENSOR27 對(duì)多糖組分進(jìn)行分析。使樣品在4 000～400 cm-1波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行掃描，得到紅外光譜圖。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。并使用Omnic 8.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水提取法

2.1.1 提取溫度

將液料比設(shè)置為25∶1（mL/g），加熱的時(shí)間為3 h，分別放置于75、80、85、90℃下進(jìn)行提取。提取率如圖1 所示。由圖1 可知，隨著溫度的提高，多糖提取率先大幅增加，而后緩慢下降。由此可知，當(dāng)提取溫度80℃時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最大值2.78%。

圖1 提取溫度與提取率的關(guān)系

2.1.2 提取時(shí)間

液料比設(shè)定為 25∶1 （mL/g），提取溫度為80℃，然后設(shè)定提取時(shí)間分別為0.5、1、2 和3 h，由此觀察提取時(shí)間對(duì)提取率的影響，從而確定最佳的提取時(shí)間，結(jié)果詳見圖2。由圖2 可知，當(dāng)溫度不變時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率逐漸提高，1～2 h 提取率增加的速度最快，由1.4%提高到2.99%，而2～3 h 提取率緩慢上升，在3 h 時(shí)達(dá)到最大值3.11%，綜合考慮時(shí)間成本，選擇最佳提取時(shí)間為3 h。

圖2 提取時(shí)間與提取率的關(guān)系

2.1.3 液料比

提取時(shí)間3 h，溫度80℃的條件下，分別以15∶1、20∶1、25∶1 及30∶1（mL/g）進(jìn)行液料的比例設(shè)置。從圖3可以看出，隨著液料比的增加，在15∶1～25∶1（mL/g），曲線呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說明火龍果莖多糖的提取率在此范圍內(nèi)逐漸增加，而后提取率下降。因此最佳液料比例為25∶1（mL/g），此時(shí)提取率最高，達(dá)4.12%。

圖3 液料比與提取率的關(guān)系

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)，使用熱水提取法時(shí)，提取最佳條件為3 h、80℃、液料比例25∶1（mL/g），提取率達(dá)到最高為4.12%。

2.2 亞臨界水提取法

2.2.1 提取時(shí)間

固定料液比為1∶40（g/mL）、140℃、pH 5，分析不同提取時(shí)間對(duì)提取率的影響，得到最優(yōu)提取時(shí)間，結(jié)果如圖4。由圖4 可看出，最適的提取時(shí)間是25 min，此時(shí)提取率達(dá)到20.53%。而提取時(shí)間更久反而得率下降，原因可能是隨著提取時(shí)間的增加，導(dǎo)致細(xì)胞破碎度逐漸增大，過多碎片阻礙多糖溶出，導(dǎo)致提取率下降［12］。

圖4 提取時(shí)間與提取率的關(guān)系

2.2.2 提取溫度

當(dāng)條件為1∶40（g/mL）、pH 5、25 min，提取溫度分別160、140、120、110℃，分析在不同溫度對(duì)提取率的影響，結(jié)果如圖5。由圖5 可知，在110～140℃，多糖提取率隨提取溫度升高而明顯增加，當(dāng)溫度為140℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大20.53%。但當(dāng)溫度達(dá)到160℃時(shí)，多糖提取率下降，這說明適當(dāng)?shù)纳邷囟瓤商岣叨嗵翘崛÷剩沁^高的溫度可通過褐變反應(yīng)致使多糖降解［13］。所以，最佳提取溫度為140℃。

圖5 提取溫度與提取率的關(guān)系

2.2.3 液料比

固定條件為140℃、pH 5、25 min，液料比例為50∶1、40∶1、30∶1、20∶1（mL/g） 時(shí)，對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果如圖6 所示。從圖6 可知，多糖提取率隨著液料比的增加先提高后降低，在液料比為40∶1（mL/g）時(shí)，提取率達(dá)到了20.53%的峰值，這可能是因?yàn)橐毫媳鹊脑黾涌梢约铀偃ルx子水向細(xì)胞中擴(kuò)散并增強(qiáng)其對(duì)多糖的吸附性［14］。隨著液料比的繼續(xù)增加，多糖提取率下降，過量的去離子水會(huì)使多糖溶解達(dá)到飽和狀態(tài)，導(dǎo)致提取率降低［15］。所以，選擇液料比40∶1（mL/g） 為最佳條件。

圖6 液料比與提取率的關(guān)系

2.2.4 pH

當(dāng)液料比為1∶40（g/mL），提取溫度140℃，提取時(shí)間25 min，探究不同pH 對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖7。從圖7 可以看出，pH 5 時(shí)，提取率達(dá)到最大值。當(dāng)pH 持續(xù)增加時(shí)，提取率有所下降。因此選擇pH 5為最適條件。

圖7 pH值與提取率的關(guān)系

采用亞臨界水提取法，以提取時(shí)間、提取溫度、液料比以及pH 值作為影響因素，最優(yōu)工藝為提取時(shí)間25 min、提取溫度140℃、液料比例40∶1（mL/g）、pH 5時(shí)，提取率達(dá)到最佳20.53%。

2.3 超聲輔助提取法

2.3.1 超聲時(shí)間

將條件固定為60℃、1∶20（g/mL）、240 W，超聲時(shí)間分別為4、9、14、19 min，分析不同超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖8。從圖8 可知，當(dāng)提取時(shí)間為9 min時(shí)，提取率最高為2.18%。

圖8 提取時(shí)間與提取率的關(guān)系

2.3.2 液料比

將條件固定為60℃，240 W、9 min，探究不同液料比對(duì)提取率造成的影響，結(jié)果見圖9。從圖9可以看出，多糖提取率隨著液料比的增加呈先升后降的趨勢(shì)，液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，提取率達(dá)到最大值。因此，選用的液料比為20∶1（mL/g）。

圖9 液料比與提取率的關(guān)系

2.3.3 提取功率

將超聲溫度固定在60℃，料液比1∶20（g/mL），超聲時(shí)間9 min，分析不同超聲功率下，提取率的變化，結(jié)果見圖10。由圖10 可知，當(dāng)超聲功率為240 W時(shí)，火龍果莖多糖的提取率達(dá)最高為2.18%。當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，超聲功率越大，機(jī)械剪切和空化作用越強(qiáng)，多糖提取量逐漸增加，但當(dāng)功率過大易導(dǎo)致糖苷鍵的斷裂，從而使多糖提取率降低［16］。因此，選用最佳超聲功率為240 W。

圖10 超聲功率與提取率的關(guān)系

2.3.4 提取溫度

將液料比固定為20∶1（mL/g），超聲功率240 W，超聲時(shí)間9 min，對(duì)不同超聲溫度下的提取率進(jìn)行比較分析，結(jié)果見圖11。由圖11 可知，當(dāng)提取溫度為60℃，提取率最高為2.18%。

圖11 提取溫度與提取率的關(guān)系

采用超聲輔助提取法，分析了4個(gè)影響因素對(duì)提取率的影響，最佳工藝為提取溫度60℃、超聲功率為240 W、液料比20∶1（mL/g）、超聲時(shí)間9 min時(shí)，提取率為2.18%。

2.4 綜合比較

在用不同提取方法所得多糖粗品后，對(duì)這些多糖粗品進(jìn)行初步的基礎(chǔ)性質(zhì)評(píng)定，包括顏色是否潔凈，形態(tài)是否穩(wěn)定，探究采用不同的提取方法對(duì)提取物造成的影響，結(jié)果詳見表1。根據(jù)表1可知，3 種方法獲得的提取物顏色相差不大；亞臨界水提取法的提取率最高為20.53%，中性糖的含量最高達(dá)到89.45%，超聲輔助提取法的提取率及中性糖含量最低，僅有38.50%；熱水提取法的提取率及中性糖含量介于二者中間。推測(cè)原因?yàn)闊崴崛r(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致多糖部分溶于水中，效果較差；而超聲輔助提取受超聲波影響，部分多糖組分溶出未能被提取，且時(shí)間較短導(dǎo)致提取率較低。但亞臨界提取法存在設(shè)備要求高，耗能高等不足，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化提取。

表1 不同提取方法所得多糖樣品的綜合比較

2.5 紅外圖譜分析

不同提取方法所得的多糖紅外光譜如圖12 所示。在3 412 cm-1處的強(qiáng)吸收峰是由-OH官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)引起，峰形較寬，表明多糖存在分子內(nèi)或分子間有氫鍵；烷基C-H在2 930 cm-1附近產(chǎn)生的伸縮振動(dòng)吸收峰是糖類物質(zhì)的典型特征吸收峰；在1 610 cm-1附近的強(qiáng)吸收峰是由C＝O 的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的；在1 419～1 200 cm-1是C-H 的變形振動(dòng)引起的吸收峰。1 078 cm-1處的一組強(qiáng)吸收峰是由糖環(huán)上C-O-C 的伸縮振動(dòng)引起的，且該峰為吡喃環(huán)的特征吸收峰［17］，說明火龍果莖多糖具有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)；891 cm-1處的吸收峰表明火龍果莖多糖具有β-型糖苷鍵。3種粗多糖紅外光譜圖均含有典型的多糖特征吸收峰，且具有相似的紅外光譜，由此可以認(rèn)定，3種粗多糖在化學(xué)結(jié)構(gòu)上基本一致。

圖12 火龍果莖多糖紅外光譜圖

3 討論與結(jié)論

火龍果莖的開發(fā)利用前景十分廣闊，除刺后，可切成片鮮食，用果汁機(jī)打碎可作冷飲或調(diào)制冰淇淋［1］。植物多糖具有多方面的生物活性，常作為保健食品的營(yíng)養(yǎng)成分，火龍果莖含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，具有特殊的生理功能，尤其是植物性多糖的含量較高。因此，火龍果莖多糖開發(fā)利用前景廣闊［2］。熱水提取、亞臨界水提取及超聲輔助提取3種方法所得火龍果莖粗多糖的提取率分別為4.12%、20.53%和2.18%，使用亞臨界水提取法的提取率最高。但亞臨界水提取法對(duì)設(shè)備的要求較高，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模提取；使用熱水提取法的提取率雖較低，但本方法對(duì)設(shè)備的要求不高，易于實(shí)現(xiàn)，只是存在提取時(shí)間較長(zhǎng)，消耗能源較大等缺點(diǎn)；超聲輔助提取法的提取率相對(duì)較低，但這種方法耗時(shí)較短。所以，多糖的提取分離應(yīng)根據(jù)不同種類多糖的性質(zhì)選擇合適的方法，盡量避免單一方法，同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用兩種或多種提取分離方法。3 種方法得到的粗多糖顏色相近；且經(jīng)紅外光譜分析3 種粗多糖具有相似的紅外光譜，均含有典型的多糖特征吸收峰，火龍果莖多糖具有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)并呈現(xiàn)β-型糖苷鍵吸收峰；不同方法提取的粗多糖樣品結(jié)構(gòu)無明顯差異。該研究為有效利用火龍果莖提供了理論依據(jù)。