我國水稻重要農藝性狀分子遺傳研究進展及在育種上的應用

李潛龍 王慧,2 方玉,2 張從合,2*

（1 上海中科荃銀分子育種技術有限公司，上海 200233；2 安徽荃銀高科種業股份有限公司/農業農村部雜交水稻新品種創制重點實驗室，合肥 230088；*通迅作者：zhangch7201@vip.sohu.com）

水稻（Oryza sativa L）是我國的主要糧食作物，具有悠久的種植歷史，詩經記載“豐年多黍多稌”，其中“稌”即為糯稻。我國水稻發展經歷兩次巨大的飛躍：一是20世紀60年代半矮稈化水稻品種革命，使水稻單產提高20%以上；二是在20世紀70年代開發的三系和細胞質雄性不育系統的雜交水稻品種，使水稻平均產量又大幅度提高了20%[1]。然而，隨著耕地面積的不斷減少、環境污染加劇、生態環境壓力逐漸增大以及人們生活水平的不斷提高，對水稻生產又提出了新的要求，不僅要高產、抗病、抗倒伏，還要求優質。預計到2030年，我國人口將會達到16.5億，糧食生產將產生巨大的缺口。在這種情況下，傳統的育種技術已經很難滿足當前水稻生產的需要，尋找新的水稻育種技術迫在眉睫。常規育種技術是通過表型間接選擇基因型，一般只對質量性狀有效，而對數量性狀則效果不明顯。這是由于數量性狀的連續變化是由多基因和環境因素控制的。近幾十年來，分子標記、轉基因技術和基因組學技術的進步對傳統水稻育種的概念和手段產生了深遠的影響，使得分子育種技術在水稻上的應用成為可能。分子育種是現代生物技術手段與傳統育種方法的結合，用于開發水稻新品種。主要涉及利用分子標記與決定目標性狀基因緊密連鎖的特點，通過檢測分子標記，即可檢測到目的基因存在的分子標記輔助選擇育種（MAS）和將特定的目的基因與轉化載體進行體外重組，然后轉入水稻中進行穩定的整合、表達和遺傳的基因工程育種（GEB）[2]。

21世紀初，我國開始了水稻功能基因組學的研究，一批與水稻重要農藝性狀相關的數量性狀位點（QTL）/基因、基因組變異和單倍型的克隆，為水稻的直接選擇和分子育種提供了堅實的基礎。

1 水稻重要農藝性狀基因的克隆

1.1 水稻產量相關基因的克隆

水稻產量性狀是由多基因控制的復雜數量性狀，受自然環境影響較大。水稻的產量構成主要分為單位面積有效穗數、每穗粒數和粒質量[3]。其中，有效穗數決定于每株水稻的有效分蘗，MOC1是我國科研人員克隆的首個調控水稻分蘗的基因，MOC1突變體由于不能形成分蘗芽而只有主莖沒有分蘗，該基因編碼GARS家族的核蛋白，過表達則分蘗數增加、株高變矮[4]。葉原基形成間隔期調控基因（PLA1）編碼細胞色素P450 CYP78A11，可以調節營養生長期葉片起始發育的速率，影響葉片數和分蘗數，從而調節有效穗數。PLA1還可以通過調節一次枝梗的發育來影響穗數[5]。

水稻的粒質量主要是由粒長、粒寬、粒厚以及籽粒灌漿的充實度來決定。GS3是水稻中克隆的第1個與粒長和粒質量有關的主效QTL，同時也是控制水稻粒寬和籽粒充實度的微效QTL。它包括N端的OSR結構域、1個跨膜區、TNFR/NGFR家族富半胱氨酸結構域、以及C端的VWFC，通過負調控穎殼細胞數目來控制水稻的粒長[6]。GW2基因編碼1個環型E3泛素連接酶，位于細胞質中，通過將其底物錨定到蛋白酶體進行降解，從而負調節細胞的分裂。其功能喪失不能將泛素轉移到靶蛋白上，因而使得本應降解的底物不能被特異識別，從而激活穎花外殼細胞的分裂，導致穎殼變大，間接地，灌漿速率加快，最終使粒寬和粒質量增加，進而產量得到提高[7]。2015年，傅向東課題組和李家洋課題組同時發表論文，揭示了1個控制水稻粒型的基因GL7，該基因編碼擬南芥LONGIFOLIA蛋白的同源蛋白，而LONGIFOLIA能調節細胞的縱向伸長，GL7位點發生了17.1kb的DNA大片段串聯重復，這一基因組結構變異導致了GL7基因表達量的上升，同時還引起了其臨近的負調控因子表達的下調，引起粒長增加，堊白度和堊白率降低，從而顯著改善稻米外觀品質[8-9]。此外，GW5[10]、GW8[11]、GS5[12]、qTGW3[13]等基因均能調控水稻的產量性狀。

2010年，李家洋院士團隊克隆了控制水稻理想株型形成的主效基因IPA1，該基因編碼1個含有SBPbox結構域的轉錄因子，調控多個生長發育過程，其功能獲得性突變體具有無效分蘗少、莖稈粗壯抗倒伏、穗大粒多產量高等優異農藝性狀[14]。2018年，陳學偉研究小組發現，IPA1不僅促進正常條件下水稻的生長，而且在受到稻瘟病菌侵染時受誘導磷酸化而增強免疫反應，這一機理使得在含有IPA1的功能獲得性基因型的水稻中，產量和稻瘟病抗性同時得到提高，這種機制打破了單個基因不可能同時實現增產和抗病的傳統觀點，為高產高抗育種提供了重要理論基礎和實際應用新途徑[15]。

1.2 水稻品質相關基因的克隆

水稻品質主要由外觀品質、加工品質、蒸煮品質、食味品質及營養品質共同決定。初期研究水稻品質相關的基因是胚乳中淀粉合成相關基因，包括控制蔗糖合成酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶等的基因。這些基因通過影響直鏈淀粉含量高低來影響稻米的食味品質。上世紀90年代，洪孟民院士率先克隆了水稻蠟質基因Wx，該基因是控制直鏈淀粉合成的主效基因，直接影響水稻胚乳和花粉中直鏈淀粉的含量[16]。蠟質基因的克隆揭示了糯稻與非糯水稻形成的分子機理，對我國稻米品質改良具有重要意義。2014年，華中農業大學的何予卿課題組克隆了1個影響水稻籽粒堊白的基因Chalk5，該基因編碼1個液泡質子轉運焦磷酸酶（V-PPase），具有無機焦磷酸鹽（PPi）水解活性和質子轉運活性，影響水稻籽粒堊白的形成和精米率等品質性狀。提高該基因的表達量可以增加胚乳堊白，可能是通過干擾發育中種子內膜轉運系統的pH穩態來實現。這個過程影響了蛋白體的形成并且與囊泡類結構顯著增加相耦連，因此在胚乳儲存物質中形成了氣體空間，從而導致了籽粒堊白的形成[17]。同年，何予卿課題組又鑒定了1個控制籽粒蛋白含量的關鍵基因qPC1，其通過調控谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白和淀粉的合成與累積來調控水稻籽粒蛋白質含量[18]。2019年揚州大學嚴長杰課題組克隆了1個控制稻米蛋白質總含量的關鍵基因Os－GluA2（qGPC-10），該研究團隊對400多份水稻種質資源的總蛋白以及貯藏蛋白含量分別進行測定，確定了胚乳中谷蛋白含量的變異是水稻總蛋白變異的決定因子；在不同環境中同時鑒定出了2個能夠穩定遺傳的控制水稻蛋白質含量的關鍵QTLs，并通過圖位克隆與功能研究明確了qGPC-10（OsGluA2）能夠顯著影響稻米蛋白質含量并最終影響稻米的營養品質[19]。水稻香味是評價水稻品質的重要指標之一，香味基因Os－BADH2（fgr）編碼甜菜堿醛脫氫酶，其功能喪失能夠導致香味物質2-乙?；?1-吡咯啉不斷積累，形成具有香味的水稻葉片和籽粒[20]。除此之外，還有GW8[11]、FLO6[21]、GIF1[22]等基因通過不同的途徑調控稻米的品質。

1.3 水稻抗病蟲害相關基因的克隆

稻瘟病、白葉枯病和紋枯病是影響水稻生產的三大病害，嚴重時可導致大面積減產甚至絕收。早在2004年，華中農業大學王石品課題組鑒定了水稻白葉枯抗病基因Xa26，該基因在粳稻中具有廣譜且持久的抗性[23]。最新研究表明，水稻磷酸丙糖異構酶TPI1.1通過與Xa3/Xa26結合增強自身酶活，通過調節體內活性氧的含量來參與Xa3/Xa26介導的白葉枯抗病途徑[24]。2014年，中國農業科學院萬建民院士課題組克隆了水稻中首個抗條紋葉枯基因STV11，該基因的抗病等位基因STV11-R編碼1個磺基轉運酶OsSOT1，該酶催化水楊酸（SA）轉化為磺化水楊酸，從而使水稻對條紋葉枯病毒具備持久抗性，而感病等位基因STV11-S失去這種活性[25]。目前為止，水稻中報道了40多個水稻抗白葉枯病QTL位點，其中被克隆的有11個基因，包括Xa1[26]、Xa3/Xa26[23]、Xa4[27]、Xa5[28]、Xa10[29]、Xa13[30]、Xa21[31]、Xa23[32]、Xa25[33]、Xa27[34]、Xa41[35]。2017年，廣譜持久抗稻瘟病基因Pigm被報道，揭示了水稻廣譜抗病性與產量平衡的表觀遺傳調控新機制，為解決作物高抗與產量之間的矛盾提供了新理論[36]。2018年陳學偉課題組在《Science》上發表了水稻理想株型關鍵基因IPA1在水稻抗稻瘟病過程中的作用，IPA1結合DEP1等穗發育相關基因的啟動子，促進其表達，調控水稻理想株型的建成與水稻產量；受稻瘟病菌誘導后，IPA1發生磷酸化修飾并改變其與DNA序列的結合特性，使得IPA1結合抗病相關基因WRKY45的啟動子，促進其表達，增強免疫反應，提高抗病性[15]。2019年萬建民院士團隊報道了1個水稻稻瘟病抗性的“閘門”基因OsCNGC9，該基因對稻瘟病抗性具有正向調控作用，能夠介導PAMP誘導Ca2+內流，這對于PAMPs觸發的ROS爆發和誘導PTI相關防御基因表達具有重要作用。進一步研究表明，PTI相關的受體樣胞質激酶Os－RLCK185能夠與OsCNGC9互作，并通過磷酸化修飾改變其通道活性，揭示了OsCNGC9在介導細胞質鈣離子升高和水稻抗病中的作用，為水稻稻瘟病抗性改良育種提供了重要的材料和新的理論基礎[37]。

褐飛虱是一種主要的水稻害蟲，每年造成水稻產量的大量損失。BPH14是水稻中克隆的第1個抗褐飛虱的主效基因，該基因編碼一種具有卷曲螺旋、核苷酸結合以及富含亮氨酸重復序列的蛋白，通過激活水楊酸（SA）信號傳導途徑來介導對褐飛虱的抗性[38]。2015年，萬建民院士團隊報道了抗褐飛虱基因BPH3，1個編碼3種質膜凝集素激酶受體的基因簇，它們共同發揮作用，賦予廣譜和持久的抗蟲性[39]。迄今為止，已從栽培稻和野生稻中鑒定出至少35個抗飛虱基因，其中Bph14、Bph3、Bph18、Bph26、Bphi008a和Bph29已被克隆[40]。

1.4 水稻耐逆相關基因的克隆

水稻在生長過程中，不僅會受到蟲害、病害和雜草危害等生物逆境脅迫，還會受到洪水、干旱、高溫、低溫以及土壤鹽堿化和重金屬污染等非生物逆境脅迫。近年來，水稻非生物抗逆性分子育種研究得到了一系列重要的進展，發現并克隆了一些基因和QTL，這些基因和QTL在水稻抗逆性育種中具有較高的應用潛力。2015年，中國科學院林鴻宣課題組克隆了第1個耐高溫的QTL基因OsTT1，該基因編碼1個參與泛素化蛋白降解的26S蛋白酶體α2亞基。泛素化組學分析表明，OsTT1通過更有效降解有毒變性蛋白以及維持高溫應答過程，進而保護植物細胞[41]。同年，種康課題組在粳稻中鑒定到了1個水稻重要耐寒性QTL基因COLD1，冷處理時，COLD1與G-蛋白α 亞基RGA互作，激活Ca2+通道，觸發下游耐寒防御反應，而后加速G蛋白GTP酶活性以平衡G蛋白動態活性[42]。2016年，薛勇彪課題組克隆了1個新的水稻耐熱關鍵基因TOGR1，該基因編碼一種溫度介導和節律調控的DEAD-Box RNA解旋酶，TOGR1參與高溫條件（25℃～40℃）下正常rRNA前體的加工，是細胞核仁SSU復合體的伴侶蛋白，對高溫下的細胞增殖十分重要，調控水稻耐熱生長[43]。2019年，中國科學院陳彩艷課題組與湖南雜交水稻研究中心袁隆平團隊克隆了1個水稻抗寒關鍵基因HAN1，該基因編碼1個氧化酶，能催化有生物活性的茉莉酰-L-異亮氨酸（JA-Ile）轉化為非活性形式12羥基-茉莉酰-L-異亮氨酸（12OH-JA-Ile），并微調JA介導的冷凍反應[44]。

鹽脅迫是造成水稻減產的重要環境因素之一。2005年，林鴻宣課題組在水稻中克隆了第1個耐鹽QTL基因skc1,該基因編碼1個HKT家族的鈉離子轉運蛋白，主要集中在木質部，地上部多余的Na+通過木質部卸載回流到根部，從而降低Na+的毒性，增強水稻耐鹽性[45]。2018年，湖南大學劉選明課題組發現1個可以在鹽脅迫條件下明顯提高水稻耐鹽性和產量的類受體胞質激酶基因STRK1，STRK1在受到高鹽滲透后發生自磷酸化，并通過磷酸化與其相互作用的過氧化氫酶C的210位的酪氨酸殘基，顯著提高過氧化氫酶活性，從而將過量有害的過氧化氫分解為水和氧氣，降低高鹽滲透造成的危害，提高水稻耐鹽性和產量[46]。

鎘是環境毒性污染的重金屬元素之一，水稻容易吸收和積累鎘元素，人體攝入鎘超標的大米會嚴重危害身體健康。2018年龔繼明課題組克隆了1個水稻葉片鎘積累的關鍵基因CAL1，該基因編碼植物防御素類似蛋白，通過螯合鎘并將其排除出細胞來降低細胞內的鎘濃度[47]。2019年，何振艷課題組采用全基因組關聯分析鑒定到了1個參與鎘轉運的主要協助轉運蛋白超家族成員OsCd1。該研究發現了參與水稻鎘吸收和籽粒鎘積累的OsCd1基因及其低鎘積累的自然變異Os－Cd1V449，對水稻鎘積累分子機制的闡釋和低鎘水稻品種的培育具有重要參考[48]。隨著基因組學的發展，越來越多參與調控水稻鎘積累的基因被克隆，如OsHMA3[49]、OsPDR5[50]、LCD[51]、OsMTP1[52]等。

2 水稻重要農藝性狀基因的應用

2.1 在提高產量上的應用

為了提高糧食產量，保證糧食安全，我國科學家采用分子育種的方法在水稻產量的提高上取得了顯著成就。李家洋院士團隊將IPA1導入優質秈、粳稻骨干親本中，充分利用秈粳雜交稻的雜種優勢，將雜種優勢和理想株型相結合，聚合了控制理想株型、抗稻瘟病、結實率、生育期等優異性狀的等位基因，育成適宜長江中下游稻區種植的“嘉優中科”系列水稻新品種[53]。郭龍彪等通過分子標記輔助選擇育種（MAS）將控制粒重的基因GW6轉入秈稻品種9311中，構建近等基因系，從中選擇出1個優良品系，該品系相對于輪回親本9311粒長和粒質量分別增加了11.0%和19.0%，單株產量增加了6.7%[54]。

2.2 在品質改良上的應用

隨著人們生活水平的提高，人們對稻米品質的要求也越來越高。王巖等把中國香稻的alk和fgr等位基因片段通過回交聚合的育種方法導入明恢63中，改良后的明恢63表現出明顯的低糊化溫度（GT）、高凝膠濃度（GC）、堊白度降低、香味增加，稻米外觀、蒸煮和食味品質均得到顯著提高[55]。高產優質雜交稻中優161是莊杰云等利用分子標記輔助育種（MAS）選育出的恢復系中恢161（攜帶有利等位基因wx），與不育系中9A配組而成[56]。LIU等采用PCR-AccI分子標記，將Wxb基因導入秈型雜交稻親本龍特甫和珍汕97中，在后代中選育出低直鏈淀粉含量的改良保持系和恢復系[57]。

2.3 在提高水稻抗病蟲害方面的應用

白葉枯病突發性強，且傳播和侵染速度快，一旦暴發，便很難控制。為了提高水稻對白葉枯病的抗性，曹立勇等采用分子標記輔助選擇的方法在帶有抗白葉枯基因XA21的材料IRBB21和感病品種IR24的雜交后代中選育出具有抗白葉枯病基因Xa21的恢復系中恢8006，并配制出優質高產抗病雜交稻國稻1號[58]。鄧啟明等利用 IRBB60（Xa21、Xa4、Xa13、Xa5）、WBB1（Xa23）、感病品種綿恢725為材料，采用復合雜交結合分子標記輔助選擇技術（MAS）得到聚合Xa21、Xa23和Xa4的雜交水稻優良恢復系綿恢725[59]。黃大輝等用抗稻瘟病品種合豐占與抗白葉枯病品系粵泰占雜交，經過多代自交選育，結合分子標記輔助選擇技術(MAS)，選育出聚合了多個抗稻瘟病基因（Pi-ta、Pib、Pi54）和抗白葉枯病兼抗細條病基因Xa5的優質、多抗恢復系桂恢663[60]。

稻瘟病每年都會造成糧食的大量減產，為了選育出高抗稻瘟病的水稻新品種，世界各國的水稻育種專家開展了大量的工作。劉雄倫等以谷梅4號和湘晚秈13為材料，通過連續回交、自交及分子標記輔助選擇（MAS），培育出含有Pigm純合等位基因、高抗苗瘟和穗瘟，且農藝性狀與湘晚秈13高度相似的BC株系，實現了稻瘟病抗性的定向改良目標[61]。朱旭東等以C101LAC和C101A51為稻瘟病抗性基因的供體親本、金23B為受體親本，通過雜交、復交及一次回交，在分離世代利用分子標記輔助選擇技術（MAS），獲得了帶有Pi-1、Pi-2和Pi-33基因的金23B導入系，對稻瘟病具有明顯的抗性[62]。倪大虎等通過分子標記輔助選擇技術（MAS）與傳統的雜交、自交相結合的方法，將抗稻瘟病的Pi9(t)基因和抗白葉枯病的Xa21及Xa23基因聚合到了同一株系中[63]。

自上個世紀70年代以來，各國科研工作者都展開了水稻抗飛虱基因的發掘與育種應用工作。朱永生等以抗褐飛虱材料B5（攜帶Bph14和Bph15）及攜帶白背飛虱抗性位點qsI-4的秈型恢復系水稻品種?；?011為供體親本、以骨干恢復系?；?76為輪回親本，采用低世代分離群體田間表型結合單株鑒定與高世代穩定株系室內篩選和分子標記輔助選擇（MAS）相結合的方法，并對抗蟲株系及其測交后代進行考查和農藝性狀分析，選育出聚合Bph14、Bph15和qsI-4的恢復系材料[64]。徐鵬等以R1813為父本，利用分子標記輔助選擇（MAS）和回交轉育技術，將MD12086-41中攜帶的稻瘟病抗性基因Pi9、白葉枯病抗性基因Xa23、褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15滲入到R1813得到聚合3種抗性基因的改良系[65]。

2.4 在提高水稻的耐逆性方面的應用

我國的鹽堿（漬）地面積大約9 913萬hm2，其中嚴重鹽漬化土壤大約3 667萬hm2，是世界鹽堿地大國。因此，開展水稻耐鹽研究，通過遺傳改良脅迫選擇提高水稻的耐鹽性，選育出耐鹽水稻品種將使鹽堿稻作區的生態環境得到有效改善，使糧食生產安全得到保障。江蘇省農業科學院等單位通過分子標記輔助選擇（MAS）與常規育種技術相結合，建立耐鹽、優質、抗病、高產多基因聚合育種技術體系，將優質、抗病、高產、耐鹽基因聚合到優良水稻品種中，育成適宜沿海灘涂種植的耐鹽水稻品種南粳9108等[66]。郭龍彪等通過基因工程的方法將CMO、BADH、mtlD、gutD和SAMDC導入秀水11中，得到9份耐鹽的優良株系或中間材料[67]。2018年全國“海水稻”區域試驗，共有28個品種表現較好。

3 利用基因工程創制水稻新材料

傳統的水稻育種技術很難將這些功能基因快速利用起來，而水稻基因工程育種是利用基因工程的手段，有目的地將外源基因導入水稻基因組，通過直接表達外源基因，或調控內源基因的表達甚至調控植物相關基因的表達，快速、高效的使水稻獲得新性狀的一種新的水稻品種改良技術?；蚬こ碳夹g為水稻新品種的培育提供了一個嶄新的途徑，可以實現物種之間遺傳物質的轉移[68]。中國水稻研究所水稻生物學國家重點實驗室通過轉基因的方法將MOC1轉基因純系與中超123雜交，獲得了大量分蘗少、農藝性狀優良、具有高產潛力的中間材料。龍起樟等以廣泛使用的雜交水稻親本華占和五豐B以及常規水稻品種五山絲苗和中早35為材料，采用CRISPR/Cas9技術將OsNramp5基因敲除，得到的基因敲除株系籽粒鎘含量低于0.1 mg/kg[69]。胡昌泉等采用農桿菌介導法將可溶性淀粉合成酶III基因（OsSSIIIa）和淀粉分支酶IIb基因（OsBEIIb）導入秈稻恢復系明恢86中，可有效的降低直鏈淀粉含量[70]。胡燕等利用農桿菌介導法將Pi-d2基因轉入秈稻品種蜀恢527中，增強了其對稻瘟病的抗性[71]。向殿軍等利用轉基因技術將擬南芥ICE1基因導入墾鑒稻10號中，顯著提高了該品種的耐寒性[72]。朱寶成等利用轉基因技術將大麥的LEA3基因轉入水稻中，并對轉基因植株進行了抗滲透脅迫能力分析，結果證明，在環境脅迫條件下，導入LEA3基因的植株可溶性糖含量、可溶性蛋白含量以及SOD活性均高于對照[73]。劉耀光等利用Cre/loxP重組系統和新創建的不可逆重組的突變loxP位點，開發了新一代的高效多基因載體系統TGS II（TransGene Stacking II）。通過使用該系統，成功把花青素合成相關的8個關鍵基因轉入水稻，實現了花青素在水稻胚乳特異合成，創造出首例富含花青素的水稻新種質“紫晶米”[74]。王克劍等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，在春優84中敲除了4個水稻生殖相關基因（PAIR1、REC8、OSD1和MTL），使雜交稻產生了無融合生殖性狀，并產生了與雜交稻一樣的克隆種子；進一步檢測確定，通過克隆種子培育的子代植株與一代雜交稻高度相似。該研究證明了雜交稻進行無融合生殖的可行性[75]。周煥斌等利用腺嘌呤堿基編輯器rBE14工具，對水稻α-微管蛋白基因OsTubA2進行了定點核苷酸編輯，獲得了對靶標除草劑二甲戊靈耐受水平達到推薦劑量的3倍、對氟樂靈也有較好的耐受性的水稻新種質[76]。

4 展望

近十幾年中，我國水稻科研工作者在水稻分子育種中取得了矚目的成就。不僅克隆解析了一批調控水稻產量、品質、抗病、抗蟲和耐逆的基因，還將這些基因運用于水稻育種，培育出一系列適應當代種植環境的水稻新品種。而且基因編輯技術也將成為一種高效的分子育種途徑。與傳統的雜交育種方法相比，它能縮短聚合優異基因的時間，并且可以得到更加豐富的遺傳種質資源。未來，隨著育種的理論和技術水平不斷提高、基因組學技術的不斷發展，水稻分子育種相關的種質資源信息將不斷完善，將會為水稻分子設計育種提供堅實的基礎。水稻育種從常規育種向分子設計育種發展是一個大趨勢，從產量、品質、選擇效率、抗病蟲性、耐逆性等方面改善水稻的農藝性狀，為保護國家糧食安全和環境安全做出進一步貢獻。