種子果實類中藥DNA條形碼鑒定的研究進展

姜 波

隨著中醫藥技術的發展，人們對中醫中藥的關注程度不斷上升，中藥的需求量也在不斷增加。中藥材的質量直接決定了中醫治療效果，中藥質量對臨床治療至關重要[1]。傳統草本記載差異和中藥命名復雜、地域廣闊有關，并且存在同物異名或同名異物的情況，還存在偽品和部分混淆的情況，導致中藥市場混亂，各地區存在用藥差異等問題，直接影響中藥的穩定性和療效性。對于中藥材種子果實類品種通過DNA條形碼技術鑒別，能夠擺脫物種的外觀形態特征和鑒別人員專業水平限制，更加客觀地避免干擾和主觀性影響，提高鑒定的準確性[2]。本文通過分析DNA條碼鑒別種子果實類中藥的研究進展，為中藥準確鑒別研究提供參考和依據。

1 DNA條碼鑒定技術

1.1 鑒定意義DNA條碼技術于2003年首次提出，通過對中藥材基源物種PCR增擴片段的分析，比對增擴產物序列情況，尋找DNA條碼后再有目的的構建條碼進行系統識別。DNA條碼鑒別是通過較短的DNA序列進行物種鑒別，該種分子生物學鑒別方法被稱為DNA條形碼鑒定技術[3]。通過DNA條形碼技術鑒別中藥，可以建立健全DNA條形碼數據庫，確立標準化的DNA鑒定操作流程，以實現中藥材分子生物學鑒定的標準化和自動化[4]。中藥DNA條碼鑒別主要意義在于：對傳統中藥鑒定方法作以補充，促進中藥資源的利用和開發，彌補傳統中藥鑒定方法人才不足情況，保護中藥資源生物多樣性，尋找形態學難以確認的隱種，利于中藥市場監督管理。

1.2 序列選擇2009年國際會議確定將葉綠體中的2個基因片段作為植物鑒別的核心DNA條碼，建議將核基因片段作為DNA條碼的補充條碼。相關研究表明在選擇的900余個樣品中，DNA條碼能夠鑒別出500余個品種，成功率高達70%以上[5]。2013年《中華人民共和國藥典》增補本將中藥DNA條形碼分子鑒定指導原則，通過對大量中藥進行DNA條碼鑒定研究，并建立了條碼鑒定體系，其中對動物類和植物類藥材的DNA條形碼體系進行確立。

1.3 序列選擇標準DNA條形碼序列圖譜之間的鑒別，需要鑒別物種之間有較大的序列差異，在選擇目標序列中應選擇有種間序列差異較大或有變異位點的序列，利于物種之間的鑒別，種內和種間存在清晰界限。DNA序列兩端應便于引物序列擴增和涉及；選擇序列應盡可能簡短便于DNA擴增。

2 DNA條碼鑒定的應用

中藥產業化進程的不斷推進，中藥材提取技術不斷更新，中藥材提取逐步工業化、規模化，導致中藥材植物和動物的數量不斷減少。中藥材開發受到物種資源短缺或滅絕的限制，為了尋找更多具有藥用價值的可代替傳統中藥材的生物資源，在中藥鑒別方面便于尋找潛在資源物種，通過DNA條碼測序構建系統發育關系，分析物種間遺傳關系，利于發現分子水平上密切聯系的物種，尋找可以代替的潛在資源。研究顯示，通過10批樣本進行DNA條形碼鑒別，能將2批次混入的其他物種準確鑒別[6]。

3 DNA條碼鑒別方法及注意事項

3.1 方法先對被鑒別物種進行樣本采集，先進行DNA提取和對PCR擴增的測序工作，根據測序結果進行分析，尋找被鑒別種屬的對應DNA序列[7]。挑選飽滿的種子果實，提取總DNA，取樣本0.3 g，用雙氧水浸泡30 min，用蒸餾水沖洗數次，在紫外燈光下照射15 min，除去外源的DNA，用石英砂冰浴研磨，預熱后取緩沖液2 ml，在水域中振搖提取，高速離心，上清液加入醋酸鉀溶液，倒入離心管中加入氯仿-異戊醇混均，反復顛倒后離心，再重復以上操作，離心后去掉乙醇，將溶液倒在吸水紙上用風機吹干，用冷凍冰箱保存。

3.2 注意事項在DNA采集和測序工作中，應注意細節操作，避免樣品攜帶的污染，在取樣時避免交叉污染，試劑污染，操作人員污染等[8]。對于潔凈度要求高的操作步驟應在超凈工作臺內操作。做好試驗記錄，出現問題或偏差后及時查找原因。實驗人員在操作中應佩戴口罩、手套，穿戴好隔離服。按照試劑使用說明要求進行操作，對于有毒、有害試劑應做好人身保護。排查數據處理實驗中各種干擾因素、儀器設備誤差等原因，以保證實驗的嚴謹性和準確性。

3.3 實例分析種子類藥材菟絲子的近緣物種多達45份，按照207條ITS2序列構建菟絲子的DNA條形碼數據庫，結合克隆測序，對從藥材市場、醫院、藥店購買的菟絲子藥材進行鑒別。結果發現70%市面銷售的菟絲子藥材存在混偽情況[9]?；靷蔚奈锓N包括埃塞俄比亞芥、茴香、大頭菜、大豆、日本菟絲子、紫苜蓿等。說明采用DNA條形碼鑒定種子果實類藥材和市場監督均有較好作用。

4 DNA條碼鑒別存在的問題

采用DNA條形碼技術鑒別的前提為確定需要鑒別的中藥基原的真偽品是否進化完全，只有進化完全的樣本才能進行該種方法的鑒別，在此基礎上再進行DNA條碼鑒別，結果會相對客觀。在鑒別植物DNA時，多采用新鮮植物葉片作為樣本，經過炮制或加工過的中藥飲片則無法進行DNA鑒別，結果回收到DNA斷裂或降解的影響，需要進一步實踐[10]。中藥DNA條碼鑒別中難以獲得完整的模板，在采集、貯藏過程中中藥樣本會因很多條件變換發生簡介，導致能夠檢測的DNA片段較小。因自身的局限性不能對礦物質藥材進行鑒別，不能在所有中藥中施展，應與傳統鑒定方法相結合，單純使用DNA條形碼鑒別技術不能保證中藥鑒別的全面性和準確性。

5 DNA條碼鑒別解決方案

在采集和存放樣本過程中應嚴格按照規范要求進行操作，避免因外界環境影響，使樣本種的DNA發生降解或遭到破壞。植物樣本應盡量采集新鮮葉片，保證完整序列和擴增模板。加強基因組的測序研究，對基因組資料進行豐富，以選擇更小的基因片段[11]。動植物分類學中DNA條碼鑒別技術較成熟，中藥材鑒別應用較廣泛，為質量監管提供新方法。

6 前景展望

雖然2003年就提出了DNA條形碼理論，并且在動植物鑒別方面有顯著成效。但DNA條碼鑒別技術還多停留在實驗研究階段，不能單獨走出實驗室，需要通過現代化的電子設備進行生物鑒別。設備上的要求給DNA條形碼鑒定技術的應用推廣提出挑戰，不能廣泛應用在中藥材鑒別上，樣本的要求不能將DNA條形碼鑒定技術應用在中成藥的鑒別中。但隨著鑒別技術研究的不斷深入，某些研究已經從人參中藥中提取到DNA，并能成功擴增核糖體序列，已完成人參混偽品的鑒別[12]。隨著DNA序列碼數據庫的逐步建立，將二維碼作為DNA序列信息的載體，通過掃描二維碼信息實現中藥鑒別的信息化[13]。不斷完成中藥質量評價標準，必將使DNA條碼技術發揮出智能、快捷、可靠的鑒別作用。希望不久的將來，中成藥真偽鑒別也能通過DNA條形碼完成。

7 小結

DNA條形碼鑒定技術可以擺脫中藥動植物物種形態特征、操作者水平、動植物生長階段等限制，提高鑒定的準確性和通用性[14]。將10個堿基組成的任意序列核苷酸片段進行基因組PCR擴張，以判斷多態性DNA的結合位點，以判斷該區域序列發生基因突變、片段插入、缺失情況引發的分子量變化，轉變為多態DNA片段[15]。通過對同屬不同種種子果實類中藥根尖體染色體、蛋白質DNA條形碼特征研究，結果說明混淆品和正品存在特征區別。通過DNA技術鑒別不同種種子果實類中藥提供了理論依據，同時建立了動植物關系為分類學研究奠定基礎。通過中藥基原鑒定和質量評價，研發便攜式設備，使DNA條形碼鑒定技術得到普及擴大使用范圍。DNA條形碼技術可與更多的科學技術聯合使用，以改善應用的不足和局限性，有效促進中藥產業現代化及規?；?/p>