以多參數(shù)Logistic回歸模型分析循環(huán)微小RNA與AMI病情及預后的關系

吳新建 鐘永富

(重慶三峽中心醫(yī)院急救部，重慶 404000)

急性心肌梗死(AMI)是由于冠狀動脈的血管壁易損斑塊發(fā)生破裂，有繼發(fā)血栓形成及炎性反應參與的急危重癥，具有極高的病死率〔1〕。因此，及時有效診斷AMI是提高患者預后的關鍵因素。目前，雖然以肌鈣蛋白作為代表的心肌損傷標志物在AMI的診斷和預后中具有重要作用，但其準確性并不高，且在多種心血管疾病中肌鈣蛋白(cTn)同樣會增加〔2〕。因此，找到敏感性和特異性強的標志物，以彌補cTn在AMI診斷中的缺陷非常重要〔3〕。微小RNA(miRNA)作為近些年發(fā)現(xiàn)的一類能夠在轉錄水平上對機體基因的表達進行精細調控的非編碼小RNA，通過堿基互補配對原則與靶基因的3′非翻譯區(qū)進行結合進而抑制基因的翻譯，在炎癥反應、發(fā)育和代謝及腫瘤形成等生理過程中發(fā)揮廣泛的調控作用〔4〕。研究表明，大腦存在某些特定的miRNA，其表達水平和神經功能紊亂密切相關，在腦部發(fā)生缺血后腦內一些基因被誘導或抑制，可能與miRNA引起mRNA的降解和翻譯過程有關〔5〕。另外，血漿中微小RNA在AMI的發(fā)生和發(fā)展過程中異常表達，可作為AMI的潛在標志物〔6〕。因此，本研究旨在探討循環(huán)微小RNA與AMI病情及預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2019年1月在重慶三峽中心醫(yī)院進行治療且診斷為AMI的患者80例作為研究組。男50例，女30例；年齡40～79〔平均(63.15±4.68)〕歲。另外，選擇60例經冠狀造影檢查陰性的患者作為對照組，男36例，女24例，年齡40～78〔平均(60.98±4.41)〕歲。3組年齡及性別等一般資料差異均為統(tǒng)計學意義(P>0.05)，有可比性。所有入組人員簽署知情同意書，且該研究方案通過醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2納入標準 ①患者均持續(xù)胸痛達30 min以上；②AMI患者的心肌損傷標志物高于參考區(qū)間的上限，其中血清cTnI>0.06 ng/ml或者肌酸激酶同工酶(CK-MB)>16 IU/L；③心電圖顯示患者具有連續(xù)兩個及以上導致典型心肌缺血的改變；④冠狀動脈造影顯示明確的血管病變排除標準：①患者為陳舊性心肌梗死；②患者具有心臟病史，例如心肌炎、心臟瓣膜病和心源性休克等；③合并患有惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全者及甲狀腺功能異常者。

1.3試劑盒儀器 總RNA提取試劑盒及反轉錄試劑盒購自Trizol公司；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit購自Ambion公司；QuantiTect SYBR Green PCR Kit購自Qiagen公司；PCR引物購自金斯瑞公司；cTnI ELISA檢測試劑盒及肌紅蛋白(MB)ELISA檢測試劑盒均購自美國R&D公司；膽固醇(TC)檢測試劑盒、三酰甘油(TG)試劑盒、CK-MB均購自英國Randox公司；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)均購自日本第一化學株式會社公司。普通PCR儀及電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)均購自BIO-RAD公司；NanoDrop 2000c購自Thermo公司；離心機及恒溫水浴箱均購自BIO-RAD公司；熒光定量PCR儀及E601電化學發(fā)光全自動免疫分析儀均購自Roche公司；AIA-2000全自動免疫發(fā)光分析儀均購自日本東曹公司。

1.4研究方法〔7〕經皮冠狀動脈介入(PCI)均由2名以上具有豐富經驗的心血管內科醫(yī)生進行手術。以3條心外膜下冠狀動脈和大分支任意段直徑狹窄≥50%作為冠狀動脈造影陽性，并按照狹窄所累及的血管，分為左主干、左回旋支、左前降支、右冠狀動脈分為單支血管病變、二支血管病變和三支血管病變，單純的左主干病計為二支病變。患者均經冠狀動脈造影證實，PCI術前AMI患者冠狀動脈主要分支狹窄均≥70%，且PCI術后其相應分支殘余狹窄程度≤20%。另外，心肌梗死溶栓(TIMI)的血流分級≥2；患者術后均采用標準藥物進行治療。患者均在就診2 h內抽取外周靜脈血4 ml；對照組均于造成空腹狀態(tài)下采取外周靜脈血4 ml。均采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，且顛倒搖勻，后凍存于-80℃冰箱待用。按照Triol試劑盒說明書抽取患者的外周血標本總RNA。抽提結果運用NanoDrop2000c紫外分光光度計對總RNA進行定量，之后運用1 μg的總RNA按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit的說明書進行逆轉錄進而合成cDNA，后凍存于-80℃待用。熒光定量PCR反應參照QuantiTect SYBR Green PCR Kit試劑盒的說明書，且以合成的cDNA作為模板在PCR儀上進行實驗。反應體系20 μl，體系如下：cDNA 1 μl；上游引物和下游引物各2 μl；2*SYBR premix Ex TagTM II PCR 7 μl；Rnase-free water 9 μl。反應條件如下：95℃ 10 min；95℃ 10 s；65℃ 30 s；72℃ 30 s，40個循環(huán)。同時以U6作為內參對照，運用CT值法比較分析各組miRNA的相對表達量。運用7300PCR軟件對熒光定量PCR儀采集的信號進行分析，觀察引物以及目的基因的標準曲線、擴增曲線。采用2-△△ct法進行相對定量分析，計算各組miRNA的相對表達水平。

1.5生化指標檢測 患者的血清生化指標均按照相應自動化分析儀以及試劑盒的說明說進行操作，其中TC采用膽固醇氧化酶法，TG運用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶(GPO-PAP)法，HDL-C和LDL-C運用間接法，運用酶耦聯(lián)法檢測CK，免疫抑制-酶動力法檢測CK-MB，cTnI和NT-pro-BNP采用化學發(fā)光法檢測。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗、Pearson相關性分析、Logistic回歸分析、受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結 果

2.1兩組血脂及心功能指標水平比較 與對照組比較，AMI組治療前血清TG水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)。與治療前相比，AMI組治療后TG、cTnI、NT-pro-BNP、CK、CK-MB顯著升高(P<0.05)，TC、GRACE評分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血脂及心功能指標水平比較〔M(Q25,Q75〕

2.2兩組治療前血清miRNA水平比較 AMI組血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

續(xù)表1 兩組血脂及心功能指標水平比較〔M(Q25,Q75〕

2.3AMI患者治療前后miRNAs水平比較 治療后，AMI患者血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平均較治療前顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清miRNAs水平比較

2.4血清miRNAs水平對AMI病情的監(jiān)測價值 血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210用于監(jiān)測AMI組和對照組ROC曲線下面積(AUC)分別為0.73(95%CI=0.63～0.82，P<0.001)、0.66(95%CI=0.55～0.76，P<0.001)、0.71(95%CI=0.61～0.81，P<0.001)、0.75(95%CI=0.61～0.83，P<0.001)、0.72(95%CI=0.57～0.79，P<0.001)。

以AMI和對照組的二類變量作為因變量，以血清mRNAs水平、性別、年齡及血脂指標(包括TC、TG、HDL-C、LDL-C)作為自變量，單因素僅納入miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平。結果提示，miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平均于AMI的發(fā)生具有相關性。而多因素模型中除了納入miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平外，還納入年齡、性別及血脂水平，結果提示：通過矯正性別、年齡及血脂水平，高水平miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210仍然可作為AMI發(fā)生的獨立預測因素。見表3。

表3 血清miRNAs的單因素及多因素Logistic回歸分析

2.5血清miRNAs水平和患者臨床參數(shù)的相關性分析 AMI組治療前血清miR146a、miR193a、miR16和miR210水平和cTNI的水平及預后GRACE評分呈正相關；血清miR146a和miR16水平還與TG水平呈正相關，血清miR208b與NT-proBNP呈負相關。見表4。

表4 血清miRNAs水平與臨床指標的相關性

3 討 論

AMI患者由于腦動脈閉塞進而導致腦組織缺血和缺氧，因此產生炎癥反應、細胞凋亡及血管再生等病理過程，且神經功能障礙為主要臨床表現(xiàn)〔8〕。研究表明〔9,10〕，在患者缺血和缺氧狀態(tài)下會導致細胞內的mRNAs水平發(fā)生變化，miRNA和低氧反應具有密切關系，且多種miRNA參與機體的大腦缺血、缺氧及再灌注損傷中的細胞凋亡。miRNA通過調控機體細胞凋亡基因、血管內皮生長因子及細胞周期基因而發(fā)揮作用〔11〕。臨床研究表明〔12〕，AMI患者中多種血清及血漿RNAs特異性表達，可作為AMI早期診斷及病情預測的標志物，且AMI患者治療前后血清中特定miRNAs的水平同樣會發(fā)生特異性的改變，表明miRNAs還可以作為監(jiān)測AMI患者PCI 治療前后的病情變化的潛在標志物。

機體在正常狀況下，血液中的一些miRNA處于穩(wěn)定狀態(tài)，因此其異常表達有助于疾病的診斷〔13〕。由于外周血的方便性及RNA提取的可操作性，使得人們能夠檢測miRNA水平來對某些疾病進行早期診斷。本研究結果表明，血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平不僅與AMI的損傷程度呈正相關，同樣可作為PCI手術治療前后患者病情變化的新型標志物。Zhu等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者PCI 手術后血漿miR181a水平相較于治療前顯著下降。Chen等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者術后miR499水平相較于手術前顯著降低，并且多支冠狀動脈患者的miR499水平顯著高于單支冠狀動脈病變的患者，與本文研究結果相一致。這是興奮性氨基酸細胞毒性作用機制是腦缺血損傷的病理生理過程的重要環(huán)節(jié)，在急性腦梗死發(fā)生后，在缺血區(qū)突觸間隙存在大量谷氨酸聚集，最終引起神經元損傷從而造成廣泛的的腦組織病理性損害〔16〕。而GLT-1作為一種興奮性氨酸轉運體的亞型，是主要的星形膠質細胞谷氨酸轉運體蛋白，其編碼基因為SLClA2。在腦梗死后，患者腦組織的miRNAs水平表達升高，并與編碼基因SLClA2的mRNA 3′UTR結合，下調mRNA表達，抑制GLT-1蛋白的表達，谷氨酸轉運功能障礙，促進神經元損傷〔16〕。

本研究結果表明，miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平可作為AMI的獨立危險因素。其中，miR146a通過機體炎癥反應參與動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展〔17〕；miR193a-5p可通過促進心臟病患者的心臟微血管的生產〔18〕；miR16在多種癌癥及心血管疾病中起重要作用，可明顯抑制腫瘤細胞的增殖及侵襲并促進細胞凋亡〔19〕；miRNA210在促進腦血管缺血后血管新生過程中起到重要作用〔20〕。因此，監(jiān)測AMI患者血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平能有效評估AMI患者疾病嚴重程度及PCI術后患者的病情變化。