miR-424介導的VEGFA低表達阻礙宮頸鱗狀細胞癌侵襲和轉移

萬紅英 王芬 張戈 俞茜 鮑夢欣

(1上饒市人民醫院婦產科，江西 上饒 334000；2南昌大學第一附屬醫院婦產科)

宮頸癌是全世界女性中僅次于乳腺癌、結腸癌和肺癌的第四大癌癥〔1〕。宮頸癌主要是由高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)基因型感染引起的〔2〕。隨著宮頸癌篩查和預防的發展，如HPV聯合檢測和HPV疫苗接種，宮頸發育異常和癌癥的早期診斷程序可降低宮頸癌的發病率和死亡率〔3〕。目前，對于宮頸癌患者的標準治療指南是放療聯合順鉑類化療，不幸的是，這些患者在最初的5年中有較高的復發率和較差的生存率〔4〕。大量的miR已被確定在各種腫瘤細胞生物過程中有重要作用，如細胞增殖、周期調控、細胞分化及細胞凋亡〔5〕。異常的miR表達參與宮頸癌的發病機制和進展，因此MicR有作為宮頸癌生物標志物的潛力〔6〕。已有研究表明miR-424對宮頸癌的診斷和預后有提示作用，抑制宮頸癌、子宮內膜癌細胞的生長、轉移和浸潤〔7〕。但miR-424對宮頸癌的具體作用機制尚未見報道，本研究旨在探討miR-424介導的血管內皮生長因子(VEGF)A低表達對宮頸鱗狀細胞癌的侵襲和轉移的影響。

1 材料和方法

1.1試驗動物 6只雄性SPF級別裸鼠，4～6周齡，體重(16±2)g，購自江西中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(贛)2018-0003。DMEM培養基(12100-046)、胎牛血清(10099-141)、胰蛋白酶(15050-057 )和青-鏈霉素(15140-122)均購自美國賽默飛世爾科技公司；CCK-8試劑盒(C0037)、LipoRNAiTM轉染試劑(C0535)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)購自上海碧云天生物技術研究所；Transwell(3374)購自美國Corning公司；熒光素酶(L7840)檢測試劑盒購自Solarbio公司；anti VEGFA(ab46154)、Ki67(ab15580)、PCNA(ab18197)、E-cadherin(ab15148)、N-cadherin(ab18203)、Vimentin(ab137321)購自英國Abcam公司。

1.2裸鼠移植瘤模型的建立〔8〕取處于對數生長的SiHa細胞，調整細胞為1×107個/ml，0.2 ml/只注射于裸鼠后背部靠近腋窩處皮下。達成瘤標準 (負荷瘤瘤徑≥0.5 cm) 后將裸鼠隨機分為兩組：Scramble組和miR-424 agomir組。miR-424 agomir組第8天后開始注射miR-424 agomir，1次/4 d，每次1 nmol/L。

1.3腫瘤體積和重量 常規飼養接種腫瘤細胞的裸鼠30天，切除腫瘤，用10%甲醛固定，計算腫瘤體積。模型建立30 d后，切下腫瘤，稱取各組裸鼠的腫瘤重量。

1.4方法

1.4.1qPCR 用Trizol法從各組SiHa細胞中提取總RNA，培養于37℃，5%CO2恒溫培養箱中，使用逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，根據qPCR試劑盒說明書進行操作，反應條件為：95℃ 2 min，95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 15 s。miR-424以U6為內參，VEGFA以GAPDH為內參。用2-ΔΔCt法進行定量計算。

1.4.2免疫組化 取各組裸鼠腫瘤組織，常規石蠟包埋制成厚度約4 μm的切片，按免疫組化檢測試劑盒說明書進行免疫組化染色，陽性表達為胞質出現棕黃色顆粒，采用光學顯微鏡觀察Ki67和VEGFA在腫瘤組織中的表達情況。

1.4.3細胞培養與分組 正常宮頸細胞系Ect1/E6E7和宮頸癌細胞系Hela、C33A、SiHa購自美國典型培養物保藏中心，將細胞置于37℃，5%CO2恒溫培養箱中用高糖DMEM培養基(含10%胎牛血清和1 %青霉素-鏈霉素)培養，每3天更換1次培養基，收集細胞時用0.25%胰蛋白酶消化，試驗選用對數生長期細胞。miR-424 mimic組采用LipoRNAiTM轉染試劑將miR-424 mimic轉染至SiHa細胞，LV-VEGFA轉染LV-VEGFA載體，miR-424+VEGFA組同時轉染miR-424 mimic和LV-VEGFA載體。

1.4.4熒光素酶報告實驗 將NC-mimic、miR-424 mimic轉染至SiHa細胞，將細胞分為3組：Control組、NC-mimic組和miR-424 mimic組，檢測miR-424過表達情況。將LV-NC、LV-VEGFA轉染至SiHa細胞，將細胞分為3組：Control組、LV-NC組和LV-VEGFA組，檢測VEGFA過表達情況。通過生物信息學網站(http://www.targetscan.org/)顯示VEGFA是miR-424-5p的潛在靶點，選用熒光素酶報告分析，構建野生型(Wt)和突變型(Mut)VEGFA 3′-UTR熒光素酶報告基因質粒，轉染至SiHa細胞，將細胞分為4組：VEGFA Wt組、VEGFA Wt+miR-424-5p mimic組、VEGFA Mut組和VEGFA Mut+miR-424-5p mimic組，采用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測細胞熒光素酶相對活性。

1.4.5CCK-8 將SW480細胞接種于96孔板(100 μl/孔)孵育24 h后，按方法1.4.3分組處理各組細胞，每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育96 h，在450 nm處用酶標儀測定OD值。

1.4.6克隆形成法 將SiHa細胞接種至6孔板，約500個細胞每孔，按方法1.4.3進行處理及分組，培養7 d后棄掉上清液，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色15 min，洗凈干燥后于顯微鏡下觀察克隆形成數目，計算克隆形成率。細胞克隆形成率(%)=細胞克隆總數/接種細胞數×100%。

1.4.7Transwell 取無血清培養基稀釋的人工基底膜，加入Transwell上室，37℃風干。取對數生長期的SiHa細胞，按方法1.4.3處理分組。上室中加入200 μl的細胞懸液，下室中加500 μl的含血清的DMEM培養基。37℃、5%CO2下培養24 h，棉簽擦去基質膠和上室細胞，多聚甲醛固定后染色。光學顯微鏡下計數并拍照，每個樣本隨機選取5個視野。

1.4.8劃痕法檢測細胞遷移 將各組細胞制成1×106個/ml的細胞懸液，加入6孔板中。過夜培養至單層細胞。然后在單層細胞上用10 μl的槍頭劃橫線，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去脫落細胞。培養24 h后取出拍照測量劃痕寬度，劃痕愈合率0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度0 h劃痕寬度。

1.4.9Western印跡 各組細胞加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。4℃下加入VEGFA、Ki67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin一抗(1∶1 000)孵育過夜，TBST清洗后加入HRP-IgG(1∶10 000)，加入電化學發光顯色液顯色。以GAPDH為內參，ImageJ軟件分析各組細胞目的蛋白與GAPDH比值。

1.5統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析進行檢驗。

2 結 果

2.1miR-424抑制裸鼠移植瘤生長 第20天，第25天，第30天miR-424 agomir組腫瘤體積〔(145.15±56.12),(265.57±137.38),(637.54±183.38)mm3〕均顯著低于scramble組〔(654.86±80.18),(1 233.43±124.24),(2 592.55±213.67)mm3,均P<0.05〕。30 d后，miR-424 agomir組腫瘤重量〔0.38±0.08)g〕顯著低于Scramble組〔(0.82±0.13)g,P<0.05〕；miR-424 agomir組miR-424表達水平(0.16±0.05)顯著低于Scramble組(1.28±0.14，P<0.01)；miR-424 agomir組Ki67、VEGFA陽性細胞數目〔(7.38±3.05)個、(4.15±1.02)個〕顯著低于Scramble組〔(45.03±2.41)個、(32.33±1.81)個,P<0.01〕。見圖1，圖2。

圖1 miR-424對裸鼠移植瘤生長的影響

圖2 免疫組化檢測Ki67和VEGFA表達(DAB，×200)

2.2miR-424與VEGFA靶向關系 與Ect1/E6E7組比較，SiHa組、Hela組、C33A組miR-424水平均顯著降低，而VEGFA水平均顯著升高(均P<0.05)。以SiHa組變化最顯著。見表1。通過Targetscan預測得到VEGFA的3′-UTR有miR-424-5p的結合位點，提示VEGFA與miR-424-5p存在靶向作用關系。見圖3。VEGFA Wt組熒光素酶活性(3.11±0.16)顯著高于VEGFA Wt+miR-424-5p mimic組(2.02±0.37，P<0.05)；Control組miR-424表達水平(1.00±0.10)顯著低于miR-424 mimic組(43.56±2.27，P<0.001)；Control組VEGFA表達水平(1.00±0.15)顯著低于LV-VEGFA組(5.37±0.83，P<0.01)；與Control組VEGFA蛋白水平(1.00±0.18)比較，miR-424 mimic組(0.11±0.06)顯著降低(P<0.05)，LV-VEGFA組(5.37±1.01)顯著升高(P<0.01)，miR-424+VEGFA組VEGFA蛋白水平(0.73±0.26)顯著低于LV-VEGFA組(P<0.05)。見圖4。

表1 不同宮頸癌細胞系中miR-424、VEGFA表達水平比較

圖3 Targetscan預測VEGFA與miR-424-5p靶向關系

1～4：Control組、miR-424 mimic組、LV-VEGFA組、miR-424+VEGFA組；圖6、9同圖4 Western印跡檢測各組SiHa細胞VEGFA蛋白表達水平

2.3miR-424介導VEGFA低表達抑制宮頸癌SiHa細胞增殖 各組細胞增殖倍數均有時間依賴性(均P<0.05)。第1天，與Control組比較，miR-424 mimic組細胞增殖信數顯著下降(P<0.05)。第2～4天，與Control組比較，miR-424 mimic組細胞增殖倍數均顯著下降(均P<0.05)；LV-VEGFA組細胞增殖倍數均顯著上升(均P<0.05)；miR-424+VEGFA組細胞增殖倍數均顯著低于LV-VEGFA組(均P<0.05)。見表2,圖5。與Control組比較，miR-424 mimic組克隆形成率顯著下降(均P<0.05)；LV-VEGFA組顯著上升(均P<0.05)；miR-424+VEGFA組克隆形成率顯著低于LV-VEGFA組(均P<0.05)。見表3。與Control組Ki67、PCNA蛋白水平比較，miR-424 mimic組均顯著降低(均P<0.05)，LV-VEGFA組均顯著升高(均P<0.05)，miR-424+VEGFA組Ki67、PCNA蛋白水平均顯著低于LV-VEGFA組(均P<0.05)。見表3，圖6。

表2 各組SiHa細胞細胞增殖倍數比較

圖5 克隆形成實驗檢測各組SiHa細胞克隆形成率(結晶紫染色，×200)

表3 各組SiHa細胞克隆形成率和Ki67、PCNA蛋白表達水平比較

圖6 Western印跡檢測各組SiHa細胞Ki67、PCNA蛋白表達

2.4miR-424介導VEGFA低表達抑制宮頸癌SiHa細胞侵襲和遷移 與Control組比較，miR-424 mimic組侵襲細胞數顯著降低(P<0.01)，LV-VEGFA組侵襲細胞數顯著升高(P<0.01)，miR-424+VEGFA組侵襲細胞數顯著低于LV-VEGFA組(均P<0.05)。與Control組比較，miR-424 mimic組細胞遷移率顯著降低(P<0.01)，LV-VEGFA組細胞遷移率顯著升高(P<0.01)，miR-424+VEGFA組細胞遷移率顯著低于LV-VEGFA組(均P<0.05)。見圖7、圖8、表4。

圖7 Transwell檢測各組SiHa細胞侵襲細胞數(結晶紫染色，×200)

圖8 劃痕法檢測各組SiHa細胞劃痕愈合率(×200)

表4 各組SiHa細胞侵襲細胞數、劃痕愈合率比較

2.5miR-424介導VEGFA低表達抑制宮頸癌SiHa細胞EMT 與Control組相比較，miR-424 mimic組E-cadherin蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)，N-cadherin、Vimentin蛋白水平均顯著降低(均P<0.05)，LV-VEGFA組E-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，miR-424+VEGFA組E-cadherin蛋白水平顯著高于LV-VEGFA組(P<0.05)，LV-VEGFA組N-cadherin、Vimentin蛋白水平顯著高于miR-424+VEGFA組(均P<0.05)，見圖9，表5。顯微鏡下觀察Control組較其他組上皮細胞有極性，細胞呈紡錘狀，長出游離的絲狀偽足，細胞排列疏松，失去細胞間的黏附力，細胞由上皮向間質轉化，發生了典型的EMT形態變化，見圖10。

圖9 Western印跡檢測各組SiHa細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平

表5 各組SiHa細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平比較

圖10 各組SiHa細胞EMT形態學變化(免疫熒光，×200)

3 討 論

宮頸癌是全世界女性中第四大最常見的腫瘤類型和第四大癌癥死因〔9〕。miR-424-5p由miR-424前體5′端臂加工而成，在腫瘤細胞中的表達存在差異，如在胰腺癌、舌鱗狀細胞癌等腫瘤細胞中高表達，而在肺癌、肝癌、宮頸癌等腫瘤細胞中低表達，有促癌或抑癌雙重作用〔10〕。

VEGFA是一種糖基化的有絲分裂原，專門作用于內皮細胞，有多種作用，包括血管生成〔11〕。研究表明VEGF是腫瘤生長的正調節劑，可促進腫瘤遷移和侵襲并抑制腫瘤細胞凋亡〔12〕。Tao等〔13〕研究發現miR-144通過直接靶向VEGFA和VEGFC對宮頸癌細胞的生長、遷移和侵襲有抑制作用。本實驗提示miR-424通過調控VEGFA的表達影響血管生成。

癌細胞過度增殖是宮頸癌病灶內重要的生物學特征，即抑制癌細胞增殖是治療宮頸癌的必要方式。Ki67是存在于細胞增殖期的蛋白質，位于10號染色體上，與細胞增殖有關，在宮頸癌中呈現高表達〔14〕。PCNA是與細胞增殖周期相關的周期蛋白，應用免疫組化方法檢測PCNA是研究腫瘤細胞增殖活性的常用方法，表達強意味著腫瘤細胞處于增殖期〔15〕。本研究表明miR-424抑制裸鼠腫瘤生長和宮頸癌SiHa細胞增殖。

超過90%的癌癥相關死亡率是由遠處轉移而不是原發腫瘤引起的，癌癥轉移是一個復雜的過程，需要許多分子和細胞事件。判斷腫瘤是否惡性與腫瘤細胞的侵襲程度相關。研究表明miR-424-5p參與腫瘤的侵襲和遷移，Wang等〔16〕研究發現miR-424-5p可通過負調節SMAD7參與上皮間質轉化，從而參與食管鱗狀細胞癌的侵襲和轉移。Wu等〔17〕研究發現miR-424-5p表達上調可增加胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時抑制細胞凋亡。本研究提示miR-424可抑制宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力。

EMT在腫瘤轉移中起重要作用，在這個過程中，上皮細胞失去其特有的形態和功能特性，從而更接近間充質細胞，黏附特性和運動性發生改變〔18〕。EMT表型的普遍特征是在腫瘤發生過程中E-cadherin的功能喪失和N-cadherin、Vimentin過表達〔19〕。Zhang等〔20〕研究發現在肝癌細胞中過表達miR-424-5p直接靶向抑制β-連環蛋白/T細胞因子抑制子，維持細胞膜上E-cadherin/β-catenin復合物，可逆轉失巢凋亡抵抗、阻止上皮間質轉化、抑制遷移活性。本研究提示miR-424具有抑制宮頸癌SiHa細胞EMT的作用。

綜上，miR-424可抑制裸鼠腫瘤生長，介導VEGFA低表達可抑制宮頸癌SiHa細胞增殖、侵襲、遷移及EMT。