姜黃素基于IL-8/MUC5ac信號通路對慢性阻塞性肺疾病大鼠的干預效果

周芳 陳林 蔡佳 譚小武 曾賽麗 賈遠航

(南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院呼吸與危重癥醫學科，湖南 衡陽 421001)

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)是一種常見的肺部疾病，其主要特征為氣流受限，并伴有氣道和肺對有害氣體所致的慢性炎癥，呈現出不完全可逆、進行性受阻等特性。近年來，隨著生活水平的不斷提高，有害氣體的增加，使其患病率逐年增加，造成嚴重的經濟和社會負擔〔1,2〕。有研究表明，病原微生物是導致慢阻肺主要原因之一，可直接導致肺損傷和呼吸黏膜受損〔3〕。但目前臨床上慢阻肺的治療效果并不理想，姜黃素屬于一種多酚類物質，主要從姜黃根莖中提取獲得，其具有較強的抗炎作用，并且其安全性較高，還原性較強〔4〕。有研究認為，其能夠改善糖皮質激素抵抗〔5〕。但目前臨床上對于姜黃素治療慢阻肺機制并不明確，因此本研究探討姜黃素治療慢阻肺大鼠的療效，為臨床上姜黃素的應用提供新的依據。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取SPF級40只SD健康大鼠，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，鼠齡(3.5±0.2)個月，體重(219.7±8.5)g。所有大鼠均養殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養時間1 w。本研究所做實驗獲南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院倫理委員會批準。

主要試劑：姜黃素(河北天旭生物科技有限公司)；鹽酸氨溴索(湘潭嘉葉源生物科技有限公司)；兔抗大鼠MUC5AC抗體(上海瑤韻生物科技有限公司)；大鼠抗小鼠白細胞介素(IL)-8抗體(天津泰澤興業生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠MUC5B抗體(上海士鋒生物科技有限公司)；人抗大鼠NE抗體(上海恪敏生物科技有限公司)；兔抗大鼠轉化生長因子(TGF)-α抗體(上海撫生實業有限公司)小鼠抗大鼠表皮生長因子受體(EGFR)抗體(武漢艾美捷科技有限公司)；外源性白三烯(LT)B4酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司)肺表面活性蛋白(SP)-D ELISA試劑盒(天津泰澤興業生物科技有限公司)；基質金屬蛋白酶(MMP)-9 ELISA試劑盒、MMP-2 ELISA試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1分組、建模及給藥 隨機選取40只大鼠中10只作為正常組，其余大鼠參照鐘蓮娣等〔6〕方法建立慢阻肺模型，在實驗1～15 d時使用2%的戊巴比妥溶液對大鼠進行麻醉，劑量50 mg/kg，在無菌的條件下進行頸中切口并分離氣管，使用頭皮針進行穿刺，氣管內滴注1 g/L的LPS溶液2 mg/kg，注射后，對大鼠進行直立旋轉2 min，使肺內藥物分布均勻，縫合后正常飼養，該日不予煙熏。陽性對照組使用劑量為30 mg鹽酸氨溴索皮下注射，2次/d；姜黃素組使用劑量為200 mg/kg姜黃素進行灌胃處理，1次/d；正常組和模型組不做任何處理。

1.2.2切片及染色 在給藥干預1 w后隨機選取各組中1只大鼠采用斷頭法處死，取肺組織，在含有4%的甲醛中固定24 h，石蠟包埋、切片、脫水，進行HE染色，在顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.2.3樣本采集 抽取五組剩余9只大鼠頸總動脈血3 ml，在抗凝管中保存，用3 000 r/min的離心機離心，10 min后，將離心靜脈血滴入EP試管中，分離上層血清，在-80℃環境下保存，待用。

1.2.4肺功能檢測 將大鼠麻醉后，分離暴露氣管，并在氣管軟骨處做環形切口，接入三通管，將氣管和三通管固定后，使用RSE3020動物肺功能檢測儀對用力肺活量(FVC)、呼氣峰值流速(PEF)、第1秒用力呼氣量進行檢測。

1.2.5肺泡灌洗液白細胞數目及分類統計 待肺功能完成后，將三通管去除后，切開胸部，對右肺門進行結扎處理，將5 ml的生理鹽水注入左肺中，進行3次沖洗，進行回收，并離心棄上清，加入200 μl PBS，進行細胞沉淀，震蕩均勻后，取20 μl，在顯微鏡下對細胞總數進行計算。剩余細胞液制備細胞涂片，待干后進行染色，并在顯微鏡下對200個細胞中巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數目進行統計，計算其比率。

1.2.6LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平檢測 采用ELISA對LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平進行檢測。

1.2.7IL-8/MUC5ac通路蛋白檢測 Western印跡檢測IL-8/MUC5ac通路中MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR通路蛋白，提取大鼠肺組織中的樣品總蛋白，將其與上樣緩沖液按比例混合，煮沸5 min后，進行電泳，并將蛋白電泳轉至PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉封閉1～2 h，然后加入一抗溶液TBST(MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR按照1∶1 000稀釋)，在4℃條件下進行震蕩過夜，再次洗滌，放入二抗溶液TBST(MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR按照1∶5 000稀釋)，室內震蕩120 min后，洗滌，顯色成像，使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內參蛋白是GAPDH。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1病理組織學觀察 正常組肺泡、纖毛形態正常，結構完整；模型組上皮細胞大量脫落，肺泡壁變薄并破裂；陽性對照組上皮細胞部分脫落，肺泡壁變?。唤S素組上皮細胞脫落不明顯，肺泡融合。見圖1。

圖1 各組肺組織病理形態學(HE，×200)

2.2各組肺功能比較 如表1所示，模型組、陽性對照組、姜黃素組FVC、PEF、FEV1均低于正常組，具有統計學差異(P<0.05)；陽性對照組、姜黃素組FVC、PEF、FEV1均高于模型組，具有統計學差異(P<0.05)；姜黃素組FVC、PEF、 FEV1均高于陽性對照組，具有統計學差異(P<0.05)。

表1 各組肺功能比較

2.3各組肺泡灌洗液白細胞數目及分類比較 如表2所示，模型組、陽性對照組、姜黃素組白細胞數、中性粒細胞比率高于正常組，且巨噬細胞、淋巴細胞比率低于正常組，具有統計學差異(P<0.05)；陽性對照組、姜黃素組白細胞數、中性粒細胞比率低于模型組，且巨噬細胞、淋巴細胞比率高于模型組，具有統計學差異(P<0.05)；姜黃素組白細胞數、中性粒細胞比率低于陽性對照組，且巨噬細胞、淋巴細胞比率高于陽性對照組，具有統計學差異(P<0.05)。

表2 各組肺泡灌洗液白細胞數目及分類、血清中LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平比較

2.4各組血清中LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平比較 模型組、陽性對照組、姜黃素組LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平均高于正常組，具有統計學差異(P<0.05)；陽性對照組、姜黃素組LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平均低于模型組，具有統計學差異(P<0.05)；姜黃素組LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平均低于陽性對照組(P<0.05)。見表2。

2.5各組肺組織中IL-8/MUC5ac信號通路蛋白表達量比較 如圖2、表3所示，模型組、陽性對照組、姜黃素組MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表達量均高于正常組，具有統計學差異(P<0.05)；陽性對照組、姜黃素組MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表達量均低于模型組，具有統計學差異(P<0.05)；姜黃素組MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表達量均低于陽性對照組，具有統計學差異(P<0.05)。

圖2 各組肺組織中IL-8/MUC5ac通路蛋白MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表達

表3 各組肺組織中IL-8/MUC5ac信號通路蛋白表達量比較

3 討 論

慢阻肺屬于一種慢性氣道炎癥疾病，其可導致黏液分泌增加，而致使炎癥加重。慢阻肺其特點為不完全可逆、呈進行性發展等，其與肺部有害氣體和有害顆粒有關〔7〕。慢阻肺主要是由氣道、肺血管等發生炎癥病變而導致，當肺部中的肺泡巨噬細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞等聚集時，會導致氣道病變，并促使肺損傷。趙春柳等〔8〕研究認為,呼吸道病毒感染在慢阻肺急性加重期常見，發熱是常見癥狀；穩定期呼吸道癥狀嚴重者對病毒易感，呼吸道病毒感染導致系統性炎癥水平升高，流感病毒顯著。

姜黃素具有較好的抗炎、抗氧化、抗癌等功能，屬于一種多效天然物質。其能夠通過抑制脂肪氧化酶、腫瘤壞死因子等發揮其療效，能夠改善關節炎、心肌炎等多種炎性疾病〔9〕。姜黃素能夠通過抗氧化而清除自由基、抗炎性反應、調脂等，起到防止動脈粥樣硬化作用。欒春雨等〔10〕研究中認為，姜黃素和布地奈德合用大鼠肺組織中IL-8、TNF-α、MMP-9等的表達量明顯降低，并與HDAC2的表達量呈負相關，這種相關性可能與大鼠肺組織的IL-8、MCP-1、TNF-α、MMP-9啟動子區與HDAC2的結合水平有關。說明姜黃素可能通過升高HDAC2的表達量和活性,增強慢阻肺大鼠對糖皮質激素的敏感性及抗炎作用。因此本研究中，建立慢阻肺模型大鼠進行治療，結果顯示，模型組大鼠肺功能低于正常組，陽性對照組和姜黃素組大鼠肺功能高于模型組，且姜黃素組大鼠肺功能高于陽性對照組，此結果說明，姜黃素可有效改善肺功能，效果顯著。

LTB4屬于花生四烯酸的代謝產物，在炎性刺激下，各類炎癥細胞均可產生LTB4。有研究表明，其能夠通過巨噬細胞和嗜酸性粒細胞等釋放，并參與慢阻肺等氣道炎癥過程，均有較強的炎癥作用〔11〕。SP-D屬于一種促炎性因子，當機體受到炎癥侵襲時，其水平顯著提高。劉海平等〔12〕研究認為，呼出氣冷凝液(EBC)和血清中SP-D、趨化因子(CCL)18表達變化在慢阻肺急性加重病情監測中具有一定價值，而且EBC中SP-D、CCL18表達變化在慢阻肺急性加重患者病情監測中更具獨特的優勢。MMP-2和MMP-9均屬于MMP家族中的一員，MMP屬于蛋白水解酶的一種，在慢阻肺的發病機制中發揮著重要作用，當MMP表達過多時，會直接導致肺部炎癥和肺實質損傷〔13,14〕。本研究結果說明，姜黃素可有效改善慢阻肺大鼠炎癥水平，效果顯著。

IL-8能夠通過與氣道表面IL-8受體結合，趨化氣道表面細胞，活化MUC5AC黏蛋白，促發炎癥。MUC5AC是由氣道杯狀細胞和黏膜下腺分泌，主要存在于氣道表面上皮細胞層，能夠被各種因素所影響，是人類呼吸道分泌較多且緊密相關的黏蛋白〔15〕。IL-8屬于多源性細胞因子，能夠促進炎癥反應，是一種重要的炎癥介質，有研究表明，其可在TGF-α和IL-1的誘導下釋放〔16〕。MUC5B屬于黏蛋白的一種，主要產生于呼吸道〔17〕。NE也稱為中性粒細胞彈性蛋白酶，其能夠聚集炎癥因子，且能夠加速氣道的破壞和肺組織的損傷〔18〕。TGF-α在細胞外基質調節中發揮著重要作用，并且在細胞外基質中起到抑制和沉淀的作用，有研究表明，TGF-α能夠通過抑制蛋白水解酶、膠原酶原等起到降解細胞外基質的表達〔19〕。EGFR屬于ErbB家族中的一員，主要存在于上皮細胞、成纖維細胞等細胞表面，屬于酪氨酸激酶型受體〔20〕。本研究結果說明，姜黃素可有效改善慢阻肺大鼠肺組織MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表達量，效果顯著。

綜上所述，姜黃素能明顯改善慢阻肺大鼠肺損傷程度，降低炎癥水平，其機制可能與IL-8/MUC5ac通路受到抑制有關，為臨床上治療慢阻肺等其他炎癥病癥提供了新的方向。