黃芩苷對系膜增生性腎小球腎炎大鼠細胞凋亡及NLRP3/caspase-1通路的影響

張晶晶 李濤 鐘黎

(貴州中醫藥大學 1第一附屬醫院腎內科，貴州 貴陽 550001；2第二附屬醫院心內科；3第一附屬醫院重癥醫學科)

系膜增生性腎小球腎炎的特征在于腎小球系膜細胞(GMC)增殖和細胞外基質(ECM)沉積，系膜增生性腎小球腎炎是終末期腎病的主要原因，但其機制尚未完全闡明〔1,2〕。免疫復合物清除、免疫調節功能障礙可促進系膜增生性腎小球腎炎發作。系膜增生性腎小球腎炎的綜合措施包括皮質類固醇、免疫抑制劑、抗血小板藥和抗血脂藥〔3,4〕，因此，抑制炎癥、GMC增殖和ECM沉積的干預措施對延緩系膜增生性腎小球腎炎進展具有重要意義。炎性體NOD樣受體蛋白(NLRP)3在調節細菌和無菌炎癥中起重要作用，其在炎癥過程中誘導白細胞介素(IL)-1β和IL-18的產生〔5,6〕。NLRP3與銜接分子和凋亡相關的斑點樣蛋白相互作用，后者具有含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)募集結構域，可用于募集和激活caspase-1。NLRP3主要存在外周血單核細胞、巨噬細胞、常規脾臟中性粒細胞和樹突狀細胞中〔7〕。NLRP3的不當激活炎癥小體可導致各種疾病的進展。例如，NLRP3炎性體的激活誘導腎臟炎癥，導致慢性腎臟病〔8〕。黃芩苷是一種從黃芩中提取的黃酮類化合物，具有強大的抗炎和抗氧化活性，黃芩苷已被用于治療各種炎性疾病，包括牙周炎、肝炎和潰瘍性結腸炎〔9〕。本研究擬探討黃芩苷對系膜增生性腎小球腎炎大鼠細胞凋亡及NLRP3/caspase-1通路的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 黃芩苷、異硫氰酸熒光素(FITC)綴合的膜聯蛋白V細胞凋亡檢測試劑盒(美國sigma公司，批號23454、65474)；貝那普利(北京諾華制藥有限公司，批號20186365)；抗Thy1.1單克隆抗體(上海碧云天生物技術有限公司，批號471585)；RNA plus酶、DNA酶Ⅰ、Omniscript RT試劑盒、實時熒光聚合酶鏈反應(PCR)試劑(寶日醫生物技術(北京)有限公司，批號180513、180427、180528、180620)；含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液(美國Sigma-Aldrich公司，批號DS4789)；二喹啉甲酸(BCA)-200蛋白質測定試劑盒(美國Pierce公司，批號10265)；兔抗鼠NLRP3、caspase-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶綴合的二抗(美國Abcam公司，批號ab61037、ab20916、ab27155、ab90174)；AU-480全自動生化儀(美國貝克曼庫爾特公司)；FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)；ABI 7500定量PCR儀(美國ABI公司)；ADVIA Centaur CP全自動化學發光免疫分析儀(德國西門子公司)；CKX53顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2實驗動物及分組 清潔級SD大鼠100只，由匯智泰康生物技術(北京)有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK(京)2018-0012，動物質量合格證號：00180617。大鼠隨機分成5組：對照組、模型組、貝那普利組(50 mg/kg，預試驗求出貝那普利的LC50為100 mg/kg，以1/2 LC50為作用劑量)、黃芩苷低、高劑量組(50、100 mg/kg)〔10〕。

1.3各實驗組的制備 模型組、貝那普利組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組通過靜脈內注射2.5 mg/kg抗Thy1.1單克隆抗體誘導實驗性抗Thy1.1系膜增生性急性腎小球腎炎大鼠〔11〕。建模成功后各藥物組給予相應藥物灌胃，每天給藥1次，連續4 w，對照組、模型組給予生理鹽水，給藥體積均為10 ml/kg。

1.4腎/體比值、24 h尿蛋白、血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平測定 試驗結束后，獲取大鼠體重、24 h尿液、腎臟組織，測定24 h尿蛋白、腎/體比值(腎臟質量/體重×100%)；同時獲取大鼠血液，分離血清，AU-480全自動生化儀測定Scr、BUN。

1.5大鼠腎組織病理觀察 腎臟組織經過脫水、脫蠟、包埋、蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察大鼠腎臟病理改變。

1.6大鼠腎小球細胞凋亡水平檢測 腎組織切片磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗15 min，加入蛋白酶工作液，37℃孵育60 min，加入100 μl FITC綴合的膜聯蛋白V反應液，避光孵育30 min，終止反應。將切片置于FACS Calibur流式細胞儀下觀察，細胞核中的棕黃色顆粒顯示為凋亡細胞。

1.7大鼠腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA水平檢測 使用RNA plus酶從腎臟組織中提取總RNA，用不含RNase的DNA酶Ⅰ處理。使用Omniscript RT試劑盒將1 μg總RNA用作模板以制備第一鏈互補DNA，使用關時熒光PCR主混合試劑在ABI 7500定量PCR儀中進行qRT-PCR，共40個循環。每個PCR循環的變性、退火、延伸條件是95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s和95℃15 s。使用GAPDH作為內參基因，將靶基因表達的相對量或倍數變化標準化。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，qRT-PCR中使用的引物序列：NLRP3正義鏈：5′-GGTAGGCACCGTCAAGGCTGAGAGTGATAC-3′，反義鏈：5′-AAGTCGCCTGTTCCTGTGATGTGCCGTAG AG-3′；caspase-1正義鏈：5′-TTGACCAGGGACAGGATATTTGAGGAGCGGTA-3′，反義鏈：5′-AAGTCGCACCGTCAAGGCTGAGTGCATAAC-3′；GAPDH正義鏈：5′-GAATGCGGATTCGAAACACGTGCATCTGATT A-3′；反義鏈：5′-TGGACTGCACCGTCAAGGCTGATGGACGAAC-3′。

1.8大鼠腎臟NLRP3、caspase-1蛋白水平檢測 裂解緩沖液提取腎臟組織總蛋白質，測定蛋白濃度后進行凝膠電泳分離蛋白質，轉移到聚偏氟乙烯膜上，用含有5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽水封閉膜2 h，將膜在4℃下用1∶500稀釋的兔抗鼠NLRP3、caspase-1抗體探測過夜，然后用辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶1 000)孵育2 h，通過使用ADVIA Centaur CP全自動化學發光免疫分析儀在X射線膠片上顯現蛋白質條帶，使用Quantity One分析軟件通過光密度測定法定量相對蛋白質表達強度。

1.9統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1各組BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎/體比值比較 與對照組比較，模型組BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎/體比值水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組水平均顯著降低(P<0.05)；黃岑苷低劑量組上述指標水平均顯著高于貝那普利組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組上述指標水平均顯著低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組與貝那普利組上述指標水平無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎/體比值水平及凋亡率比較

2.2各組腎組織HE染色比較 對照組腎小球結構正常；模型組基底膜、腎小球系膜細胞明顯增生腫脹，伴炎癥細胞浸潤；貝那普利組及黃芩苷高劑量組腎小球系膜細胞輕度增生，炎癥細胞浸潤減少；黃芩苷低劑量組仍然可見炎癥細胞浸潤，腎小球腫脹增生。見圖1。

圖1 各組腎組織病理學改變(HE，×400)

2.3各組腎小球細胞凋亡率比較 與對照組比較，模型組腎小球細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組腎小球細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；黃芩苷低劑量組腎小球細胞凋亡率顯著高于貝那普利組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組腎小球細胞凋亡率顯著低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組與貝那普利組腎小球細胞凋亡率無統計學差異(P>0.05)。見表1。

2.4各組腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA水平比較 與對照組比較，模型組腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組上述指標水平均顯著降低(P<0.05)；黃芩苷低劑量組上述指標水平均顯著高于貝那普利組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組上述指標水平均顯著低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組與貝那普利組上述指標水平無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA及NLRP3、caspase-1蛋白水平比較

2.5各組腎臟NLRP3、caspase-1蛋白水平比較 與對照組比較，模型組腎臟NLRP3、caspase-1蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組上述指標水平降低(P<0.05)；黃芩苷低劑量組上述指標水平均顯著高于貝那苷利組(P<0.05)；黃芩苷高劑量組上述指標水平均顯著低于黃芩苷低劑量組(P<0.05)，黃芩苷高劑量組與貝那普利組上述指標水平無統計學差異(P>0.05)。見表2、圖2。

1～5:對照組，模型組，貝那普利組，黃芩苷低劑量組，黃芩苷高劑量組圖2 各組腎臟NLRP3、caspase-1蛋白水平比較

3 討 論

黃芩苷已被證明具有抗氧化、抗菌、抗炎和清除自由基的活性。黃芩苷還在體外和體內表現出抗流感病毒A(H1N1)活性，其作為細胞中干擾素(IFN)-γ的有效誘導劑，可抑制病毒在vero細胞內的復制。黃芩苷可誘導人肝癌HepG2和SMMC-7721細胞凋亡，并顯著抑制裸鼠中異種移植物的生長〔12〕。在HBE16氣道上皮細胞中，黃芩苷通過抑制核轉錄因子(NF)-κB信號通路激活進而抑制IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α表達，抑制輔助性T細胞17反應并減少二氧化硅誘導的炎癥和纖維化〔13〕。貝那普利可抑制血管緊張素Ⅰ向血管緊張素Ⅱ轉化，其能降低周身系統血壓，擴張腎小球出入動脈，降低腎小球內的壓力，延緩腎小球損害，是治療系膜增生性腎小球腎炎的首選藥物〔14〕，因此將貝那普利作為陽性對照藥物。本次研究結果說明黃芩苷對大鼠系膜增生性腎小球腎炎具有保護作用；能明顯抑制系膜增生性腎小球腎炎大鼠細胞炎癥及凋亡。

NLRP3是最佳表征的細胞內受體，在免疫和炎癥中起著至關重要的作用；其激活后，NLRP3經歷構象變化并與稱為凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)相互作用〔15,16〕，ASC又通過caspase活化和募集結構域將NRLP3橋接至天冬氨酸蛋白水解酶-1前體(procaspase-1)，進而激活caspase-1，得到NLRP3、ASC、caspase-1多蛋白復合物，其作為介導半胱天冬酶1自激活的分子平臺。caspase-1由無活性的半胱天冬酶-1合成，并在多蛋白復合物(包括ASC和NLRP3，稱為炎性體)內通過二聚化和自身蛋白水解活化〔17〕。活化的caspase-1是IL-1β和IL-18釋放，細胞死亡所必需的，并且在炎癥中起關鍵作用〔18～20〕。本研究結果說明黃芩苷可抑制系膜增生性腎小球腎炎大鼠腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表達進而抑制NLRP3/caspase-1通路的激活。

綜上，黃芩苷能明顯抑制系膜增生性腎小球腎炎大鼠細胞炎癥及凋亡，其機制可能與黃芩苷抑制系膜增生性腎小球腎炎大鼠腎臟NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表達進而抑制NLRP3/caspase-1通路的激活有關。