葛根素對卡那霉素耳中毒小鼠耳蝸Calpain1活性的影響

盧偉 衛玲燕 任延鑫 李鑫宇 寶東艷

(錦州醫科大學 1第一臨床學院骨科，遼寧 錦州 121001；2第一臨床學院2015級；3基礎醫學院生理學教研室)

聽力障礙是世界主要健康問題之一。全世界每500名新生兒中就有1例患有聽力障礙，65歲以上近1/3患有聽力障礙〔1，2〕。由于耳蝸神經元和耳蝸毛細胞不能再生，耳毒性藥物、噪聲及年齡都可造成耳聾。鈣蛋白酶(Calpain)是一類廣泛分布于哺乳動物胞質中的鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶。Calpain1和Calpain2是此家族中研究最廣泛的成員，都是由28和80 kD亞單位組成的異二聚體。近年來發現，在慶大霉素、丁胺卡那霉素及新霉素等氨基糖甙類誘導的內耳細胞死亡中有鈣蛋白酶的參與〔3～5〕。前期研究發現，葛根素能拮抗卡那霉素(KM)的耳毒性，本實驗通過制備KM耳中毒小鼠模型，結合聽腦干反應觀察葛根素對KM耳中毒的拮抗作用，同時探討葛根素發揮作用是否與 Calpain1有關。

1 材料與方法

1.1實驗動物 BALB/c雄性小鼠40只，體重25～30 g。由大連醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK( 遼) 2004-0029。

1.2主要試劑和儀器 葛根素注射液購自康普藥業股份有限公司，批號H20043980。硫酸KM(粉劑)生理鹽水溶解使用，購自美國 Ameresco公司，每日新鮮配制。兔抗Calpain1單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，β-actin 購自武漢博士德生物工程有限公司。Smart EP&OAE聽覺誘發電位記錄系統購自美國智聽公司。

1.3分組及小鼠耳毒模型制備 BALB/c小鼠隨機分成4組，每組10只。正常對照組：腹腔注射等量生理鹽水；KM組：KM皮下注射 750 mg/kg，2次/d；KM+葛根素組：皮下注射KM 750 mg/kg，2次/d，同時腹腔注射葛根素200 mg/kg，1次/d；葛根素組：腹腔注射葛根素200 mg/kg，1次/d，4組均連續注射14 d，14 d內每天監測體重，根據體重調整藥量。

1.4聽腦干反應(ABR)測試 ABR測試需要在隔音屏蔽室內進行，同時注意動物保溫。用藥前測ABR以進行正常BALB/c小鼠的篩選，每種藥物停藥后分別測ABR進行聽力損傷后聽閾的測定。測定ABR的方法：小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉100 mg/kg，在小鼠顱頂正中皮下插入電極的正極，給聲側耳郭下插入負極，在對側耳郭后下插入接地電極，用聽覺誘發電位記錄系統給予小鼠短純音刺激，依次選取8、12、24 kHz進行測試，記錄小鼠ABR閾值的變化，短純音刺激從80 dB開始，以5 dB逐次遞減，剛出現ABRⅠ波的值為聽閾標準，每只小鼠每側耳至少重復2次。

1.5Western印跡 實驗結束后，分別測試ABR，斷頭處死小鼠后，迅速取出聽泡，之后取出聽泡內的小鼠耳蝸組織，迅速置于液氮中，放入-80℃冰箱中備用。按照Western印跡說明書操作，加入裂解液后勻漿，離心5 min后取上清，加入緩沖液后離心，變性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉移至硝酸纖維素膜上。封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，加入二抗，發光顯影，計算Calpain1/β-actin作為蛋白相對表達量。

1.6統計學方法 應用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組ABR閾值比較 停藥后，KM組3種頻率的ABR閾值較給藥前明顯提高，提示小鼠的聽力下降，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；KM+葛根素組ABR閾值較正常對照組升高，但低于KM組，差異有統計學意義(P<0.01)。葛根素組停藥后較給藥前聽力無明顯變化(P>0.05)，見表1。

表1 各組腦干聽覺閾值

2.2Western印跡檢測Calpain1蛋白表達 KM 組(0.69±0.13)與正常對照組(0.48±0.12)比較，Calpain1表達水平明顯升高(P<0.05)。KM+葛根素組(0.58±0.14)明顯高于正常對照組，但明顯低于KM組(P<0.05)。正常對照組與葛根素組(0.50±0.12)差異不顯著(P>0.05)，見圖1。

圖1 各組Calpain1蛋白表達

3 討 論

雖然KM等氨基甙類抗生素在臨床上廣泛應用于治療危及生命的細菌性感染，但KM有顯著的劑量依賴性耳毒性〔6〕。目前認為，氨基甙類藥物的主要耳毒性靶點是毛細胞，毛細胞死亡后，螺旋神經節神經元在數周或數月開始退化。隨著氨基甙類用藥劑量或用藥時間的延長，首先損傷毛細胞高頻基底部，低頻的尖端隨后損傷〔7〕。氨基甙類誘導的毛細胞變性被認為是與活性氧(ROS)介導的凋亡有關〔8，9〕。

雖然Calpain在許多細胞功能中起重要作用，但其過度激活已被證明與許多疾病有關。在已鑒定的15種Calpain亞型中，Calpain1和Calpain2(又名m-calpain)廣泛分布于包括耳蝸在內的大多數組織和器官中〔10〕。Calpain是鈣敏感的中性半胱氨酸蛋白酶，參與凋亡和壞死途徑的調節〔11，12〕。Calpain1與內耳細胞凋亡的相關性表明，Calpain1很可能是KM誘導內耳細胞凋亡的介質〔13〕。本研究結果提示Calpain1介導了KM的耳毒性，與Li等〔13〕結果一致。

葛根原產于東南亞，幾千年來一直被用作食物、藥物和飼料，是中國古代最早使用的草藥之一〔14〕。葛根素是從葛根中分離出來的3種主要的異黃酮化合物之一〔15〕，已被廣泛用于治療心血管疾病、腦血管疾病、癌癥、帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)、糖尿病及糖尿病并發癥。對發熱、炎癥、高脂血癥、骨壞死、酒精引起的疾病和氧化損傷也有保護作用。葛根素具有抑制鈣內流、改善微循環、降低胰島素抵抗、清除氧自由基、抗細胞死亡、抑制酒精攝入等多種藥理作用。

臨床報道葛根素能改善內耳的血液循環，擴張血管，治療突發性耳聾和神經性耳鳴有明顯療效〔16〕。不同濃度組葛根素均能拮抗慶大霉素對離體小鼠耳蝸的損傷〔17〕。同時，葛根素可有效抑制順鉑所致小鼠耳蝸Calpain2的高表達，以減輕順鉑的耳毒性，改善小鼠聽功能。前期研究表明〔18，19〕，葛根素能通過拮抗核因子(NF)-κB p50和NF-κB p65的活化易位，改善KM所致的小鼠耳毒性。本研究結果表明，同時應用KM和葛根素小鼠耳蝸表達Calpain1明顯減少，同時聽力損傷也有所改善，提示葛根素對KM損傷小鼠耳蝸的保護作用可能與下調Calpain1有關，葛根素單獨應用對小鼠聽力無損害，因此，葛根素具有廣闊的應用前景。