miR-100-5p靶向mTOR信號通路調控人非小細胞肺癌A549細胞自噬

桂坤 黃昱 王美錦 歐陽偉煒

(1貴州醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，貴州 貴陽 550004；2貴州省腫瘤醫院胸部腫瘤科)

肺癌是全球性發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。據統計，2012年約有160萬人死于肺癌，占全球癌癥死亡人數的19%〔1〕。事實上，僅肺癌死亡人數就超過了緊隨其后的3種最常見癌癥：結腸癌、乳腺癌和前列腺癌的死亡人數的總和〔2〕。目前臨床上肺癌的治療主要是以手術治療為主，輔以放療、化療和藥物治療等綜合治療。然而，與絕大多數實體瘤一樣，肺腺癌存在多種原癌基因誘發、耐藥性高、惡性侵襲轉移等問題，使其針對性的治療和篩查十分困難。因此，確定非小細胞肺癌(NSCLC)的詳細分子機制及尋找新的生物標志物，將有助于開發更好、更具體的臨床治療方法。表觀遺傳調控機制在誘發基因突變，進而促進腫瘤發生、發展中起到關鍵性作用。miRNAs是一類短、非編碼RNA分子(約22個核苷酸長)，通過與靶向mRNA的3′非翻譯區結合，阻礙靶基因的表達，在基因轉錄后調控發揮關鍵作用〔3〕。miRNAs主要參與了細胞增殖、凋亡、代謝等關鍵細胞功能，常被認為與腫瘤的發生發展密切有關。細胞自噬是控制細胞存活和死亡的重要生理活動〔4〕。mTOR是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有多種生理功能，如細胞周期調節、增殖、分化、運動和侵襲等。事實上，自噬在腫瘤的發生過程中起著雙刃劍的作用〔5〕。mTOR通常被認為是一種促生長因子，是凋亡的抑制劑。細胞應激后，mTOR下調抑制細胞生長和增殖，促進自噬和凋亡。而細胞質中p53可抑制mTOR信號傳導，抑制自噬。研究發現miR-100在多種腫瘤中通過靶向mTOR影響其發生發展，這對未來腫瘤的靶向性治療研究提供了很好的參考價值〔6〕。我們將miR-100-5p的模擬物(mimics)和抑制劑(inhibitor)轉染A549細胞，采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR)檢測轉染后miR-100-5p、自噬相關基因Beclin1、LC3、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2及mTOR的相對表達量，同時檢測細胞的凋亡率，采用熒光素酶實驗檢測A549細胞中miR-100-5p與mTOR誘導的自噬之間的關系。本研究旨在探討miR-100-5p調控自噬相關的信號通路mTOR，參與腫瘤自噬過程，進一步揭示miRNA涉及表觀遺傳在腫瘤細胞調控的詳細機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人肺腺癌細胞系A549購自中國科學院上海細胞庫。DMEM高糖培養基及胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；miR-100-5p mimics、miR-100-5p干擾序列inhibitor和對應的陰性無關序列NC由上海吉瑪公司設計合成；Lipofectamine2000轉染試劑購自Thermo Fisher公司。青霉素及鏈霉素購自美國Invitrogen公司。本研究所使用的抗體：GAPDH抗體mTOR蛋白抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自生工生物工程(上海)公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒、蛋白裂解液及Trizol試劑購自美國Thermo Scientific公司；所有引物由生工生物公司提供。細胞培養瓶、細胞凍存管購自美國Corning公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人肺癌A549細胞株由中國科學院上海細胞庫提供，采用含10%FBS的DMEM完全培養基，置于37℃，5%CO2的培養箱中進行培養。選取對數生長期的A549，以4×105個細胞每孔的密度接種于6孔培養板，培養過夜后觀察細胞融合情況，以進行后續實驗。

1.2.2細胞轉染實驗 對于6孔板中培養的A549細胞，待其貼壁融合至70%～80%時，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后使用Lipofectamine2000試劑進行轉染實驗，實驗分為5組，設置如下(每組有3個平行樣)：對照組、mimics組、mimics NC組、inhibitor組和inhibitor NC組。參照Lipofectamine2000操作說明書，將miR-100-5p mimics，miR-100-5p mimics NC，miR-100-5p inhibitor和miR-100-5p inhibitor NC與Lipofectamine 2000按比例混合，室溫靜置20 min。每孔中加入200 μl，20 nmol/L的核酸，補Opti-MEM至1 ml，對照組加入等體積溶劑對照。轉染6 h后換成完全培養基，繼續培養48 h后，使用細胞刮刀收集細胞用于后續鑒定實驗。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測miR-100-5p與mTOR的相對表達檢測 使用Trizol 裂解液提取收集轉染與未轉染的A549細胞的總RNA，具體操作如下：細胞懸液先經800 r/min離心5 min后，去除上清液，加入1 ml的裂解液，使用振蕩器振蕩混勻數下，將樣品放在室溫下5 min，隨后在4℃ 12 000 r/min離心5 min，留取上清，放入一個無核糖核酸酶(RNase)離心管中，加入200 μl氯仿，經上下劇烈振蕩數秒，隨后在室溫下放置5 min，再4℃ 12 000 r/min離心10 min再將水相取出，加入與轉移液等體積的異丙醇混合放入-20℃中30 min，4℃ 12 000 r/min離心30 min，再加入100 μl的75%乙醇沉淀后，加入100 μl的無水乙醇清洗1遍后，加入15～30 μl RNase-Free ddH2O2，室溫溶解。使用TaKaRa 反轉錄試劑盒對總RNA(約500 ng)進行逆轉錄，采用PCR擴增自噬基因Beclin1，LC3和內參基因GADPH；miR-100-5p及內參U6。Beclin1的引物正義鏈：5′-GGAGCTGCCGTTATACTGTTC-3′，反義鏈為5′-TCTCCACATCCATCCTGTAGG-3′；LC3的引物正義鏈：5′-GGTGATCATCGAGCGCTACA-3′,反義鏈：5′-CGCCGGATGATCTTGACCAA-3′；GADPH的引物為正義鏈為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，反義鏈：5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′；mTOR的引物正義鏈：5′-AGGCCTTGGTGAGAGCTGTA-3′，反義鏈：5′-GGCACACATTTGAAGAAGCA-3′；U6的引物正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 分組方法同1.2.2，培養48 h后，棄掉細胞上清液，用PBS洗1遍，0.25%胰蛋白酶進行消化，PBS洗滌2遍調整細胞密度成1×106個/ml懸液，依次加入5 μl的Annexin V-FITC與3 μl的PI，室溫避光孵育10 min，使用BD流式細胞儀系統進行檢測，實驗重復3次取平均值。

1.2.5Western印跡 將各組細胞樣本PBS清洗，RIPA裂解液冰上裂解30 min，離心測上清中蛋白的濃度，加入適量的1×十二烷基硫酸鈉(SDS)結合緩沖液，煮沸5 min。采用不連續系統蛋白質SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，待轉膜完成后，馬上將聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入TBST溶液中漂洗1～2 min，隨后加入5%脫脂奶粉封閉液，于室溫下封閉1 h。孵育一抗：先按蛋白Marker將PVDF膜剪開轉膜后，參考一抗附說明書要求的比例稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，接著加入TBST洗滌液清洗3次，每次持續15 min；孵育二抗：參考二抗使用說明書，按1∶2 000的比例稀釋辣根過氧化物酶(HPR)標記的二抗，接著將PVDF膜加入已經稀釋好的二抗，在室溫下孵育60 min；最后置于TBST洗滌3次，每次15 min；顯色后拍照。

1.2.6靶基因預測及雙熒光素酶報告基因測定 靶基因預測采用Targetscan軟件預測miR-100-5p下游靶基因，隨后采用雙熒光酶素報告基因檢測進行鑒定。操作如下：轉染前1 d將細胞接種于24孔板，使用Lipo fectamine 2000混合miR-100-5p mimics和含有野生型與突變型mTOR 3′UTR的報告基因質粒共轉染A549細胞。培養48 h后，將收集的細胞轉移到1.5 ml EP管中，液氮反復凍融兩次，4℃，12 000 r/min離心5 min，收集上清，轉移到新的1.5 ml EP中，獲得細胞提取液。將細胞提取液及熒光素酶反應底物25℃水浴10 min。在新的離心管中分別加入100 μl熒光素酶反應底物及20 μl細胞提取液，振蕩混合，15 s內讀數。

1.3統計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1A549細胞中miR-100-5p和mTOR的相對表達情況 A549細胞經過瞬時轉染后，對照組、mimics NC組、inhibitor NC組的miR-100-5p、自噬相關基因mTOR、Beclin1、LC3和Bcl-2表達量差異無統計學意義(P>0.05)，與mimics NC組比，mimics組miR-100-5p、自噬相關基因表達量顯著上調(P<0.05)，與inhibitor NC組比，inhibitor組miR-100-5p、自噬相關基因表達量顯著下調(P<0.05)，與mimics組和mimics NC組比較， inhibitor組miR-100-5p、自噬相關基因表達量顯著下調(P<0.05)，見表1。

表1 各組A549細胞中miR-100-5p和mTOR的相對表達情況

2.2miR-100-5p誘導A549細胞凋亡 對照組、mimics NC組、mimics組、inhibitor NC組、inhibitor組A549細胞轉染48 h細胞凋亡比例分別為(5.87±0.78)%，(5.46±0.99)%，(10.40±1.75)%，(5.47±0.68)%，(5.28±1.02)%，各組差異有統計學意義(F=35.169，P<0.001)。mimics組A549細胞轉染48 h細胞凋亡比例顯著高于其余組(均P<0.05)。

2.3轉染后細胞中自噬相關基因蛋白表達情況 對照組、mimics NC組、mimics組mTOR蛋白水平分別為0.42±0.13，0.13±0.04，0.92±0.24，mTOR蛋白水平比較：mimics組>對照組>mimics NC組(F=56.661，P=0.000)。見圖1。表明mTOR為miR-100-5p的直接靶基因，miR-100-5p對mTOR呈正向調控，具原癌基因作用，在肺癌細胞中促進自噬，抑制凋亡密切相關。

圖1 轉染miRNA mimics的肺癌細胞自噬蛋白mTOR的表達

2.4mTOR是miR-100-5p的靶基因 mTOR是miR-100-5p的靶基因mTOR報告基因活性mimics組(1.03±0.11)、mimics+野生型組(0.49±0.06)和mimics+突變型組(1.07±0.12)，3組mTOR報告基因活性存在差異(F=26.417,P=0.000)。與mimics組比，mimics+野生型組mTOR報告基因活性明顯降低，差異有統計學意義(t=12.929,P=0.000)；與mimics組比，mimics+突變型組mTOR報告基因活性無明顯增高，差異無統計學意義(t=0.737,P=0.482)；與mimics+野生型組比較，mimics+突變型組mTOR報告基因活性明顯增高，差異有統計學意義(t=12.969,P=0.000)。表明miR-100-5p mimics能使細胞的野生型mTOR下調，而對突變型報告基因活性的影響無明顯差異，miR-100-5p均可以靶向抑制mTOR使其表達下調。

3 討 論

肺癌是世界范圍內最常見的癌癥，其特點是對化療和放療均具有高耐藥性和復發率，死亡率極高，約占全球癌癥相關死亡總數的四分之一以上〔7〕。早期肺癌可進行手術切除以獲得較高的治愈率，但晚期肺癌存在侵襲性轉移明顯降低了治療效果〔8〕。按照病理組織學分類可將肺癌分為兩個亞型，NSCLC(85%)和小細胞肺癌(SCLC，15%)，兩者治療方法和機制存在一定的差異。其中，在NSCLC中，多種基因的突變、缺失和重組會誘發信號通路和生理活動的異常〔9〕。此外，NSCLC進一步分為3種主要的亞型，包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌。鱗狀細胞癌占20%～30%，通常發現于靠近氣管的肺部中心。腺癌占40%～70%，發生于肺部外側。大細胞癌占10%～15%，發生于肺組織內部〔10〕。目前，NSCLC的免疫檢查點抑制劑的使用極大地促進了臨床腫瘤免疫治療的快速發展。

miRNAs是一種非編碼、進化保存的小分子RNA，能夠通過不同的機制調控基因表達〔11〕。研究表明miRNAs在肺部疾病的發展中起著重要的作用〔12，13〕。據報道，肺癌患者腫瘤組織中Dicer酶的水平顯著降低，對其預后生存率有明顯影響，而Dicer是miRNAs成熟所必需的酶〔14〕。在SCLC中，miR-17～92過表達促進腫瘤的發生和血管的新生〔15〕。Liu等〔16〕也證實了miR-31在NSCLC中抑制腫瘤發展的抑制基因。此外，在非吸煙者和吸煙者肺癌患者中，miR-21均有較高的表達水平〔17〕。miR-100位于mir100HG簇，是一種長鏈非編碼RNA，也產生let-7和miR-125b。這3個成熟的miRNA都參與了癌癥的發生和發展〔18，19〕。在肺癌中，let-7的表達通常較低，這對接受手術治療的患者的生存有負面影響〔20〕。研究表明，miR-100-5p可能通過靶向mTOR誘導SW480細胞的自噬死亡〔21〕。Wang等〔22〕報道miR-100-5p在缺氧誘導的大鼠肺動脈高壓中可抑制mTOR信號通路。自噬失調在腫瘤的發病不同的病程中調控機制存在差異〔23〕。自噬在肺癌的發展中扮演極其重要的作用，在促進NSCLC細胞凋亡中具有兩面性。一般來說，自噬的抑制限制了細胞克服壓力和維持穩態的能力〔24〕。

研究表明miR-100在高轉移能力的A549中呈低表達，具有類似抑癌基因〔25〕。本研究結果提示miR-100-5p在自噬調控中作用十分重要。