miR-103a-3p靶向CEMIP基因調控肺癌細胞增殖與凋亡的分子機制

張麗萍 楊靜 段學波 王慎臨 吳萍

(寧夏人民醫院呼吸內科，寧夏 銀川 750001)

肺癌發病率較高且患者5年生存率極低，早期診斷、藥物治療等均是影響肺癌患者死亡的重要原因〔1〕。由于肺癌早期臨床癥狀不明顯導致大部分患者就診時已處于肺癌晚期，晚期患者錯失最佳治療時機導致生存率降低〔2〕。因而肺癌早期診斷及評估預后的有效指標成為當前研究亟待解決的問題。研究表明微小RNA-103a-3p(miR-103a-3p)在膠質瘤發生及發展過程中發揮抑癌作用，上調miR-103a-3p表達可抑制膠質瘤干細胞的惡性進展〔3〕。miR-103a-3p在膀胱癌細胞中呈低表達，miR-103a-3p過表達可抑制膀胱癌細胞增殖進而減緩癌癥進展〔4〕。研究報道指出miR-103a-3p在非小細胞肺癌中發揮抗腫瘤作用，但關于其具體作用機制尚未明確〔5〕。然而，miR-103a-3p在肺癌發生及發展過程中具體作用機制的研究相對較少。通過靶基因預測發現CEMIP基因可能是miR-103a-3p的靶基因，研究表明CEMIP在卵巢癌細胞中呈高表達，并可通過激活PI3K/AKT信號通路進而促進卵巢癌發生及發展〔6〕。Miao等〔7〕研究表明抑制CEMIP表達可抑制視網膜母細胞瘤增殖、遷移及侵襲。胰腺癌患者血清中CEMIP表達水平顯著升高，其可作為臨床診斷胰腺癌的重要輔助指標〔8〕。然而，關于miR-103a-3p是否通過調控CEMIP基因表達進而參與肺癌發生及發展過程仍未可知。因此，本研究探討miR-103a-3p及CEMIP在肺癌細胞增殖及凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人正常肺上皮細胞BEAS-2B與肺癌細胞H1299、A549、SPC-A-1均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購自碧云天生物技術研究所；RPMI1640培養基均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒與碘化丙啶(PI)均購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA蛋白裂解液購自上海翊圣生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；Trizol試劑購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒、實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒均購自德國Roche公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；miR-103a-3p mimics、miR-103a-3p抑制劑(anti-miR-103a-3p)、si-CEMIP及其陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因鑒定試劑盒購自美國Promega公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國R&D公司；兔抗鼠細胞周期蛋白(Cyclin)依賴性激酶(CDK)4、CyclinD1一抗均購自英國Abcam公司；兔抗人B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)多克隆抗體及CEMIP一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養、轉染及分組 取出凍存的BEAS-2B、H1299、A549、SPC-A-1細胞，37℃水浴鍋內復蘇細胞，4℃條件下，1 000 r/min轉速離心5 min，棄上清，加入含有10%FBS及雙抗溶液(青霉素-鏈霉素混合溶液)的RPMI1640培養基，放入溫度37℃、CO2體積分數5%、相對濕度95%的培養箱內培養，待細胞生長融合度達到80%時，棄舊培養基，用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，加入0.2%胰蛋白酶消化細胞，5 min后加入含有10%FBS及雙抗溶液(青霉素-鏈霉素混合溶液)的RPMI1640培養基進行傳代培養，待細胞穩定傳代2～3代后收集對數生長期細胞進行后續實驗。取對數生長期A549細胞，轉染前1 h將培養基更換為Opti-MEM減血清培養基，參照Lipofectamine2000轉染試劑盒進行轉染，將miR-103a-3p mimics、miR-103a-3p抑制劑(anti-miR-103a-3p)、si-CEMIP及其陰性對照分別轉染至A549細胞，命名為miR-con組、miR-103a-3p組、anti-miR-103a-3p組、anti-miR-NC組、si-con組、si-CEMIP組。同時將miR-103a-3p mimics與pcDNA共轉染入肺癌A549細胞，miR-103a-3p mimics與pcDNA-CEMIP共轉染入肺癌A549細胞，命名為miR-103a-3p+pcDNA組、miR-103a-3p+pcDNA-CEMIP組。轉染后置于溫度37℃、CO2體積分數5%、相對濕度95%的培養箱內培養，轉染6 h后更換為含有10%FBS及雙抗溶液(青霉素-鏈霉素混合溶液)的RPMI1640培養基，繼續培養48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.2.2qRT-PCR 采用Trizol法提取細胞總RNA，微量核酸蛋白分析儀測定RNA濃度，RNA濃度為100～500 ng/μl，A260/A280(吸光度值)在1.9～2.1為合格樣本，參照反轉錄試劑盒合成cDNA，置于-20℃冰箱保存。利用qRT-PCR試劑盒進行qRT-PCR，配制體系共20 μl，其主要包括10 μl的SYBR Premix，1 μl的cDNA樣本，上下游引物各0.5 μl，ddH2O補足體系至20 μl。每個樣本均設置3個復孔，反應條件為95℃ 5 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環35次。以2-ΔΔCt法計算miR-103a-3p和CEMIP的mRNA相對表達量。

1.2.3Western印跡 取對數生長期人正常肺上皮細胞BEAS-2B與肺癌細胞H1299、A549、SPC-A-1及轉染后各組A549細胞，4℃，1 000 r/min轉速離心10 min，加入RIPA蛋白裂解液裂解細胞30 min提取細胞總蛋白，BCA法定量蛋白，配制分離膠(12%)與濃縮膠(5%)，取適量蛋白樣品加入上樣緩沖液(比例為1∶4)，充分混勻后上樣(蛋白量20 μg)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，反應條件為起始電壓80 V，樣品指示劑進入分離膠電壓調整為120 V，反應結束后將分離的蛋白凝膠轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，轉膜反應條件為電壓80 V，時間為90 min，溫度為4℃，Tis-HCI緩沖液(TBST)洗滌蛋白凝膠，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗滌后加入蛋白一抗(稀釋倍數1∶500)，4℃條件下孵育24 h，TBST洗滌后加入二抗(稀釋倍數1∶5 000)，室溫孵育1 h，加入增強型化學發光試劑(ECL)顯影，放入凝膠成像系統分析蛋白表達情況。

1.2.4MTT比色法檢測細胞增殖 分別收集轉染后各組肺癌A549細胞，接種于96孔板，每組均設置3次重復，調整細胞密度(1×105個細胞/ml)，放入溫度37℃、CO2體積分數5%、相對濕度95%的培養箱內繼續培養24 h、48 h、72 h、96 h后加入MTT溶液(20 μl)，室溫孵育4 h后吸取上清，向每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，室溫孵育25 min，置于酶標儀內檢測波長為490 nm處各孔吸光度值。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集轉染48 h后各組A549細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度(1×106個細胞/ml)，采用預冷的PBS清洗2次×5 min，加入100 μl結合緩沖液懸浮細胞，依次加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，充分混勻后避光孵育10 min，上機前各流式管內加入400 μl結合緩沖液，流式細胞儀檢測各組A549細胞凋亡情況。

1.2.6雙熒光素酶報告基因測定 利用靶基因預測庫預測miR-103a-3p與CEMIP的3′UTR存在結合位點，構建熒光素酶報告載體，將含有miR-103a-3p結合位點的CEMIP 3′UTR片段插入熒光素酶報告基因載體構建野生型WT-CEMIP載體，將結合位點突變后的CEMIP 3′UTR片段插入熒光素酶報告基因載體構建突變型MUT-CEMIP載體，將上述兩種載體分別與miR-103a-3p mimics或陰性對照共轉染至肺癌A549細胞，放入溫度37℃、CO2體積分數5%、相對濕度95%的培養箱內繼續培養48 h后使用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性變化。

1.3統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-103a-3p和CEMIP在人肺癌細胞和人正常肺上皮細胞中的表達 人正常肺上皮細胞BEAS-2B中miR-103a-3p的表達水平顯著高于人肺癌細胞H1299、A549、SPC-A-1(P<0.05)，其中肺癌A549細胞中miR-103a-3p的表達水平相對其他肺癌細胞顯著降低(P<0.05)，與BEAS-2B細胞比較，人肺癌細胞H1299、A549、SPC-A-1中CEMIP的mRNA及蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，其中肺癌A549細胞中CEMIP的mRNA及蛋白表達水平顯著高于其他肺癌細胞(P<0.05)。見圖1、表1。因此后續研究中以肺癌A549細胞為研究對象。

圖1 Western印跡檢測CEMIP蛋白表達

表1 各組miR-103a-3p和CEMIP表達水平比較

2.2上調 miR-103a-3p表達對人肺癌細胞A549增殖的影響 通過將miR-103a-3p mimics轉染至肺癌A549細胞，qRT-PCR驗證轉染效率，結果顯示，miR-103a-3p組肺癌A549細胞中miR-103a-3p的表達水平顯著高于miR-con組(P<0.05)，表明轉染成功。與miR-con組比較，miR-103a-3p組肺癌A549細胞在轉染48 h、72 h、96 h后細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)。miR-103a-3p組肺癌A549細胞中CDK4、CyclinD1的蛋白表達水平相較于miR-con組顯著降低(P<0.05)，見圖2、表2。表明上調miR-103a-3p表達可通過下調CDK4、CyclinD1的蛋白表達進而抑制肺癌細胞增殖。

圖2 Western印跡檢測人肺癌細胞A549增殖相關蛋白和凋亡相關蛋白的表達

表2 上調miR-103a-3p表達對肺癌細胞增殖的影響

2.3上調miR-103a-3p表達對人肺癌細胞A549凋亡的影響 轉染miR-103a-3p mimics后肺癌A549細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Bcl-2表達顯著下調(P<0.05)，Bax表達顯著上調(P<0.05)，見圖3，圖4，表3。表明上調miR-103a-3p表達后可通過下調Bcl-2表達及上調Bax表達進而促進肺癌細胞凋亡。

圖3 檢測人肺癌細胞A549凋亡率

圖4 Western印跡檢測凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達

表3 上調miR-103a-3p表達對人肺癌細胞A549凋亡的影響

2.4miR-103a-3p靶向調控CEMIP蛋白表達 利用靶基因預測網站鑒定miR-103a-3p的靶基因及其在CEMIP基因的3′UTR中的結合位點，見圖5。雙熒光素酶活性測定結果顯示，在含有miR-103a-3p與CEMIP基因的3′UTR結合位點的WT-CEMIP野生型質粒細胞中，與miR-con組比較，miR-103a-3p組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，在含有結合位點突變基因的MUT-CEMIP突變型質粒細胞中，miR-103a-3p組熒光素酶活性與miR-con組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。表明miR-103a-3p可調控CEMIP的活性。與miR-103a-3p組(EMIP蛋白(0.32±0.04)比較，miR-con組(0.76±0.08)顯著升高(P<0.05)，與anti-miR-103a-3p組CEMIP蛋白(0.97±0.07)比較，anti-miR-con組(0.79±0.06)顯著下降(P<0.05)，見圖6。表明miR-103a-3p可負向調控靶基因CEMIP表達。

圖5 CEMIP的3′UTR中含有與miR-103a-3p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-con組，miR-103a-3p組，anti-miR-con組，anti-miR-103a-3p組圖6 Western印跡檢測各組CEMIP表達水平

2.5沉默CEMIP抑制人肺癌細胞A549增殖和誘導凋亡 轉染si-CEMIP后肺癌A549細胞CEMIP的蛋白表達水平較si-con組顯著降低(P<0.05)，表明成功干擾肺癌A549細胞CEMIP的高表達。沉默CEMIP后肺癌A549細胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，CDK4、CyclinD1、Bcl-2表達顯著下調(P<0.05)，Bax表達顯著上調(P<0.05)，見圖7、表5。表明沉默CEMIP可通過下調CDK4、CyclinD1、Bcl-2表達及上調Bax表達進而促進肺癌細胞凋亡并抑制細胞增殖。

表5 沉默CEMIP抑制人肺癌細胞A549增殖和誘導凋亡

2.6CEMIP過表達逆轉了上調miR-103a-3p抑制人肺癌細胞A549增殖和誘導凋亡的作用 與miR-103a-3p+pcDNA組比較，miR-103a-3p+pcDNA-CEMIP組肺癌A549 48 h后細胞增殖活性顯著增強(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，CDK4、CyclinD1、Bcl-2表達顯著上調(P<0.05)，Bax表達顯著下調(P<0.05)，見表6、圖8。表明CEMIP過表達可逆轉miR-103a-3p過表達對肺癌細胞增殖的抑制作用及凋亡的促進作用。

1，2：si-con組，si-CEMIP組圖7 Western印跡檢測人肺癌細胞A549增殖相關蛋白表達

表6 CEMIP過表達逆轉了上調miR-103a-3p抑制人肺癌細胞A549增殖和誘導凋亡的作用

1，2：miR-103a-3p+pcNDA組，miR-103a-3p+pcNDA-CEMIP組圖8 檢測人肺癌細胞A549中CEMIP、CDK4、CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表達

3 討 論

肺癌是一種呼吸系統惡性腫瘤，已嚴重影響人類生命安全，但肺癌發病機制尚未完全闡明〔9〕。miRNA作為單鏈非編碼RNA分子，其在動植物、細菌等微生物基因組內廣泛存在，并可通過調控相關基因表達進而發揮促進或抑制疾病進展作用〔10〕。已有研究表明部分miRNA表達異常與肺癌發生及發展密切相關〔11〕。但仍有部分miRNA與肺癌發病機制的關系尚未完全闡明，因此需進一步探討miRNA表達與肺癌發生及發展的關系為進一步闡明肺癌發病機制及提高臨床治療效果提供一定依據。

miR-103a-3p在肝癌細胞中呈低表達，miR-103a-3p過表達后可能通過靶向調控鋅指蛋白(FEZF)1/細胞分裂周期25A蛋白(CDC25A)表達進而明顯抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞周期停滯于G0/G1期，促進細胞凋亡〔12〕。乳腺癌組織及細胞中miR-103a-3p的表達水平明顯降低，上調miR-103a-3p表達可通過抑制PDK4表達而降低細胞糖酵解水平進而抑制細胞增殖〔13〕。但相關研究發現miR-103a-3p在胰腺癌細胞中表達水平升高，抑制miR-103a-3p表達可抑制癌細胞增殖，同時另有研究報道指出miR-103a-3p在結直腸癌組織中呈高表達并可通過激活Wnt信號通路進而促進癌癥進展〔14,15〕。以上研究結果表明miR-103a-3p在不同組織中表達方式不同，可能發揮促癌作用，又可發揮抑癌基因作用，從而調控腫瘤發生及發展過程。已有研究表明miR-103a-3p在肺癌組織中表達水平降低，并可抑制肺癌細胞增殖、遷移及侵襲〔16〕。本研究結果說明miR-103a-3p在肺癌發生過程中可能發揮抑癌基因作用；miR-103a-3p過表達可抑制肺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡進而減緩肺癌惡性進展過程。細胞周期異常是引發腫瘤的重要原因之一，CDK4與CyclinD1是調控細胞周期的重要因子，CyclinD1過度表達而促使其與CDK4結合形成復合物增多，誘導細胞周期進入G1/S期刺激細胞生長進而促使細胞周期異常〔17〕。本研究結果說明miR-103a-3p過表達可通過降低CDK4、CyclinD1表達而誘導細胞周期停滯于G0/G1期進而抑制細胞生長。提示miR-103a-3p可通過影響細胞周期調控因子表達而抑制肺癌細胞生長。細胞凋亡與細胞增殖失衡是誘導腫瘤進展的重要原因之一，Bcl-2與Bax在細胞凋亡過程中發揮重要作用，抑制Bcl-2表達而上調Bax表達可誘導肺癌細胞凋亡〔18,19〕。本研究結果提示miR-103a-3p可通過上調Bax表達及下調Bcl-2表達進而促進肺癌細胞凋亡。

CEMIP在結直腸癌中表達水平升高，長鏈非編碼RNA CASC19可通過調控miR-140-5p/CEMIP軸進而調控結直腸癌進展過程〔20〕。CEMIP過表達可促進前列腺癌細胞遷移及侵襲進而其惡性發展進程〔21〕。沉默CEMIP可通過抑制Wnt /β-連環蛋白/Snail信號轉導途徑及抑制EMT轉換進程進而抑制結腸直腸癌發展〔22,23〕。本研究結果表明不同肺癌細胞系中CEMIP的表達水平較正常肺上皮細胞明顯升高，提示CEMIP在肺癌生過程中可能發揮促癌作用；沉默CEMIP表達后可通過下調CDK4、CyclinD1、Bcl-2表達及上調Bax表達進而抑制肺癌細胞增殖并促進細胞凋亡；miR-103a-3p可通過抑制CEMIP表達及調控肺癌細胞增殖、凋亡相關蛋白表達進而抑制肺癌發生及發展過程。