miR-214-5p通過(guò)調(diào)控SFRP2影響人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、凋亡

林顏 阮樹(shù)斌 陳曉東 楊榮華 王婧薷 林澤鵬 信琪

(佛山市第一人民醫(yī)院燒傷整形創(chuàng)面修復(fù)外科，廣東 佛山 528000)

瘢痕疙瘩形成過(guò)程主要涉及瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)及細(xì)胞凋亡能力不斷削弱等過(guò)程，而皮膚傷害或持續(xù)性刺激均可造成瘢痕疙瘩〔1〕。目前關(guān)于瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，導(dǎo)致瘢痕疙瘩的治療成為醫(yī)學(xué)難題〔2〕。因此，如何抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖并促使其凋亡成為主要研究領(lǐng)域。研究表明微小RNA-214(miR-214)在瘢痕疙瘩中表達(dá)水平顯著低于正常皮膚組織，但其具體作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道〔3〕。已有研究表明微小RNA-214-5p(miR-214-5p)在骨肉瘤和肝癌中均呈下調(diào)表達(dá)，miR-214-5p過(guò)表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞和肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔4,5〕。但miR-214-5p對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的影響尚未可知。利用生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-214-5p可能調(diào)控靶基因，發(fā)現(xiàn)分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)2在瘢痕疙瘩中呈高表達(dá)〔6,7〕。本研究通過(guò)miR-214-5p過(guò)表達(dá)與沉默SFRP2表達(dá)并觀察人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的變化。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自上海博升生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒與Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SFRP2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒均購(gòu)自大連寶生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-214-5p mimic、miR-NC、si-SFRP2、si-NC均購(gòu)自上海吉瑪基因制藥技術(shù)有限公司；熒光素酶表達(dá)載體及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Progema公司。

1.2方法

1.2.1人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 選取2017年2～10月佛山市第一人民醫(yī)院收治的10例瘢痕疙瘩患者為研究組，所有患者進(jìn)行手術(shù)切除，于術(shù)中切取瘢痕疙瘩組織，置于-80℃超低溫冰箱保存。另選取同期佛山市第一人民醫(yī)院收治的10例非瘢痕疙瘩患者為對(duì)照組，于術(shù)中切取正常皮膚組織，置于-80℃超低溫冰箱保存。術(shù)前患者均未接受藥物或其他治療，且患者及家屬均知情且簽署同意書(shū)。取出凍存組織標(biāo)本，去除結(jié)締組織后置于離心管內(nèi)，加入膠原酶溶液(含1 g/L的RPMI1640)，離心后置于恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，10 h后棄未消化組織標(biāo)本，經(jīng)1 200 r/min轉(zhuǎn)速的離心機(jī)離心5 min，棄上清液后加入RPMI640混勻，1 200 r/min轉(zhuǎn)速的離心機(jī)離心5 min后棄上清液，然后加入含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，混勻后調(diào)整細(xì)胞濃度，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，分別收集生長(zhǎng)良好的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KFB)與正常皮膚成纖維細(xì)胞(NFB)進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 收集KFB細(xì)胞并經(jīng)胰酶消化后接種于6孔板，依據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別將miR-214-5p mimic、miR-NC、si-SFRP2、si-NC轉(zhuǎn)染至KFB細(xì)胞，分別為miR-214-5p組、miR-NC組、si-SFRP2組、si-NC組。將pcDNA-SFRP2質(zhì)粒(miR-214-5p+pcDNA-SFRP2組)、pcDNA質(zhì)粒(miR-214-5p+pcDNA組)分別與miR-214-5p mimic共同轉(zhuǎn)染至KFB細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-214-5p、SFRP2 mRNA表達(dá)水平 取各組細(xì)胞分別加入1 ml Trizol裂解細(xì)胞并提取總RNA，應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度與純度并經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)條帶是否完整，取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，miR-214-5p、SFRP2引物均由上海生物工程股份有限公司合成，按照qRT-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置qRT-PCR反應(yīng)體系20 μl，ABI 7500 qRT-PCR儀檢測(cè)miR-214-5p、SFRP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4Western印跡蛋白表達(dá)量 分別收集各組細(xì)胞，分別加入RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法定量蛋白，制備蛋白樣品與上樣緩沖液混合液，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下脫脂奶粉封閉1 h，4℃條件下加入蛋白一抗(1∶1 000)孵育24 h，TBST洗膜，室溫下分別加入IgG二抗(1∶3 000)孵育2 h，置于自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值。

1.2.5MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 分別收集各組KFB細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后接種至96孔板(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)，24 h、48 h、72 h時(shí)每孔分別加入20 μl MTT溶液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后棄上清，每孔分別加入150 μl DMSO振蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm時(shí)各孔相對(duì)吸光度值(OD)。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組KFB細(xì)胞，0.25%胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度(1×106個(gè)細(xì)胞/ml)，配制Annexin V-FITC(5 μl)與結(jié)合(500 μl)，分別加入KFB細(xì)胞，室溫避光孵育15 min，分別加入5 μl PI，利用流式細(xì)胞儀在1 h內(nèi)完成檢測(cè)，計(jì)算各組KFB細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) miR-214-5p和SFRP2的靶向關(guān)系 通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件檢索調(diào)控SFRP2的基因，發(fā)現(xiàn)miR-214-5p可能調(diào)控SFRP2基因，構(gòu)建含有miR-214-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型WT-SFRP2質(zhì)粒與含有miR-214-5p結(jié)合位點(diǎn)突變的突變型MUT-SFRP2質(zhì)粒，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將WT-SFRP2、MUT-SFRP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KFB細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)染miR-214-5p mimic或miR-NC培養(yǎng)24 h，根據(jù)雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞熒光值。分別將miR-NC、miR-214-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-214-5p轉(zhuǎn)染至KFB細(xì)胞(miR-NC組、miR-214-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-214-5p組)，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，采用Western印跡檢測(cè)SFRP2蛋白表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1KFB和NFB中miR-214-5p和SFRP2表達(dá)水平比較 KFB細(xì)胞中miR-214-5p表達(dá)水平顯著低于NFB細(xì)胞(P<0.05)，而SFRP2 mRNA與蛋白表達(dá)水平顯著高于NFB組(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 SFRP2蛋白在KFB和NFB中的表達(dá)

表1 miR-214-5p在KFB和NFB中的表達(dá)

2.2miR-214-5p過(guò)表達(dá)對(duì)KFB增殖的影響 miR-214-5p組KFB細(xì)胞增殖活力明顯低于miR-NC組(P<0.05)，與miR-NC組相比，miR-214-5p組CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而p21、p27蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

圖2 miR-214-5p過(guò)表達(dá)對(duì)KFB中增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 miR-214-5p過(guò)表達(dá)對(duì)KFB增殖的影響

2.3miR-214-5p過(guò)表達(dá)對(duì)KFB凋亡的影響 轉(zhuǎn)染miR-214-5p mimic后KFB細(xì)胞凋亡率顯著高于miR-NC組(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而B(niǎo)ax、酶切caspase-3表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3、圖4、表3。

圖3 miR-214-5p過(guò)表達(dá)對(duì)KFB中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 miR-214-5p過(guò)表達(dá)對(duì)KFB中凋亡率的影響

表3 miR-214-5p過(guò)表達(dá)對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KFB)凋亡的影響

2.4miR-214-5p靶向調(diào)控SFRP2的表達(dá) SFRP2與miR-214-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖5。共轉(zhuǎn)染miR-214-5p mimic與WT-SFRP2野生型質(zhì)粒的KFB細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-SFRP2野生型質(zhì)粒的KFB細(xì)胞(P<0.05)，表明miR-214-5p可與SFRP2基因的3′UTR結(jié)合而調(diào)控其活性。miR-214-5p組SFRP2蛋白(0.17±0.03)顯著低于miR-NC組(0.58±0.05，P<0.05)；anti-miR-214-5p組SFRP2蛋白(0.92±0.08)顯著高于anti-miR-NC組(0.59±0.06,P<0.05)。見(jiàn)圖6、表4。

1～4:miR-NC組，miR-214-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-214-5p組圖6 miR-214-5p調(diào)控SFRP2蛋白的表達(dá)

圖5 SFRP2的3′UTR中含有與miR-214-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5抑制SFRP2表達(dá)對(duì)KFB增殖和凋亡的影響 相較于si-NC組，轉(zhuǎn)染si-SFRP2可顯著抑制細(xì)胞增殖及顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖7、表5。

圖7 抑制SFRP2表達(dá)對(duì)KFB增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表5 抑制SFRP2表達(dá)對(duì)KFB增殖和凋亡的影響

2.6SFRP2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-214-5p過(guò)表達(dá)對(duì)KFB增殖和凋亡的作用 共轉(zhuǎn)染miR-214-5p mimic與pcDNA-SFRP2后細(xì)胞增殖活力顯著高于miR-214-5p+pcDNA組(P<0.05)，與miR-214-5p+pcDNA組比較，miR-214-5p+pcDNA-SFRP2組細(xì)胞凋亡能力顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖8、表6。

1～2：miR-214-5p+pcDNA組，miR-214-5p+pcDNA-SFRP2組圖8 SFRP2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-214-5p過(guò)表達(dá)對(duì)KFB增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

表6 SFRP2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-214-5p過(guò)表達(dá)對(duì)KFB增殖和凋亡的作用

3 討 論

瘢痕疙瘩形成實(shí)質(zhì)為結(jié)締組織增生，主要是創(chuàng)傷愈合后結(jié)痂部分過(guò)度生長(zhǎng)導(dǎo)致的一種異常瘢痕組織，嚴(yán)重影響患者身心健康，目前臨床尚無(wú)有效治療方案〔8〕。研究表明KFB增殖過(guò)快及細(xì)胞非正常凋亡是導(dǎo)致瘢痕疙瘩形成的主要原因〔9〕。miRNA可通過(guò)抑制靶基因表達(dá)進(jìn)而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，從而減緩瘢痕形成〔10〕。

miR-214-5p在胰腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-214-5p表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞遷移及侵襲〔11〕。Li等〔12〕研究表明miR-214-5p可通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)而抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移及侵襲。研究報(bào)道指出miR-214-5p可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Ⅳ型膠原蛋白α表達(dá)，進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞存活及細(xì)胞外基質(zhì)形成過(guò)程〔13〕。miR-214-5p的表達(dá)變化主要集中于腫瘤發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程。本研究結(jié)果說(shuō)明miR-214-5p表達(dá)水平降低可能參與瘢痕形成過(guò)程。miR-214-5p過(guò)表達(dá)后KFB細(xì)胞中p21、p27蛋白表達(dá)水平升高，而CyclinD1蛋白表達(dá)水平降低。研究顯示p21、p27蛋白表達(dá)水平升高可抑制CyclinD1與CDK4/6形成復(fù)合物，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖〔14,15〕。同時(shí)本研究結(jié)果提示miR-214-5p過(guò)表達(dá)能夠通過(guò)影響凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)KFB凋亡。

研究表明SFRP2在KFB中呈高表達(dá)，并可通過(guò)調(diào)控Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路進(jìn)而參與傷口愈合過(guò)程〔16～18〕。本研究結(jié)果提示miR-214-5p可能通過(guò)調(diào)控靶基因SFRP2表達(dá)，進(jìn)而參與瘢痕疙瘩形成過(guò)程。本研究結(jié)果提示miR-214-5p可通過(guò)抑制SFRP2表達(dá)，進(jìn)而抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上，miR-214-5p過(guò)表達(dá)能明顯抑制KFB增殖活性，并提高細(xì)胞凋亡水平，其作用機(jī)制可能為通過(guò)抑制靶基因SFRP2表達(dá)而發(fā)揮作用的，并可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡蛋白表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖/凋亡的平衡狀態(tài)。