LncRNA LINC01446靶向miR-432-5p對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其分子機制

田貴金 劉軍紅 陳晶 張小龍 楊志森

(1邯鄲市第一醫院綜合外科，河北 邯鄲 056002；2武安市第一人民醫院產科)

肝癌是常見的惡性腫瘤，發病率和死亡率高，手術和放化療是其主要治療手段，肝癌的復發和轉移嚴重影響患者治療效果、患者預后和生存期，深入研究肝癌的分子機制，尋找分子靶標，對于肝癌的靶向治療具有重要的意義〔1,2〕。研究表明長鏈非編碼RNA(LncRNA)參與多種腫瘤的發生、發展及預后，部分LncRNA也參與肝癌的發生發展過程，可作為診斷的生物標志物或治療的靶點〔3〕。LINC01446是一種新的LncRNA，研究發現敲低LINC01446可抑制膠質母細胞瘤細胞增殖，阻止細胞周期進展并減少體外侵襲〔4〕。還有研究報道LINC01446與胃癌的總體存活率相關〔5〕。此外研究發現miRNA也參與腫瘤的發展發展，麥冬腺苷-B通過Linc00668/miR-432-5p抑制人肺腺癌細胞的轉移和上皮-間質轉化〔6〕。LncRNA癌癥易感性候基因(CASC)15通過競爭性結合miR-432-5p上調Toll-樣受體(TLR)4而促進心臟肥大〔7〕。然而，LINC01446和miR-432-5p對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及LINC01446與miR-432-5p之間的關系尚未清楚。本實驗旨在研究LINC01446和miR-432-5p對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及LINC01446是否通過調控miR-432-5p影響肝癌細胞的進展，為肝癌的分子靶向治療提供參考和新靶點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1肝癌組織和肝癌細胞來源 肝癌組織和癌旁組織均取自邯鄲市第一醫院，患者均知情。正常肝細胞THLE-2和肝癌細胞MHCC97L、Hep3B、Huh7、HCCLM3購自美國菌種保藏中心(ATCC)。

1.1.2主要試劑 RPMI1640培養基購自美國Sigma公司；熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen公司；RIPA蛋白裂解液、四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室、基質膠購于美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。si-con、si-LINC01446、pcDNA、pcDNA-LINC01446、miR-con、miR-432-5p、anti-miR-con、anti-miR-432-5p載體質粒購自北京源生思創生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組 正常肝細胞THLE-2和肝癌細胞MHCC97L、Hep3B、Huh7、HCCLM3用RPMI1640培養基培養，取對數生長期細胞Hep3B，將si-con、si-LINC01446、pcDNA、pcDNA-LINC01446、miR-con、miR-432-5p分別轉染至Hep3B細胞中，分別記為si-con組、si-LINC01446組、pcDNA組、pcDNA-LINC01446組、miR-con組、miR-432-5p組；將si-LINC01446質粒分別與anti-miR-con、anti-miR-432-5p共轉染至Hep3B細胞中，分別記為si-LINC01446+anti-miR-con組、si-LINC01446+anti-miR-432-5p組；以正常培養的細胞作為對照(NC)組。

1.2.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LINC01446和miR-432-5p表達水平 提取癌組織及各組細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，進行PCR擴增，相對表達量用2-△△Ct法計算。LINC01446上游引物序列：5′-ACTGCAGCATTCGAGAGGTT-3′，下游引物序列：5′-TCCACACATGGCATACACCT-3′；β-actin上游引物序列：5′-CCTGTGGCATC-CACGAAACT-3′，下游引物序列：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′；miR-432-5p上游引物序列：5′-AACGAGACGACGACAGAC-3′，下游引物序列：5′-CTTGGAGTAGGTCATTGGGT-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3Western印跡檢測細胞核增殖抗原標記物(Ki67)、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、β-連環蛋白(catenin)、c-myc蛋白和糖原合成酶激酶(GSK)-3β蛋白表達水平 提取各組細胞總蛋白，定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后室溫封閉2 h，再分別加入一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育90 min，分析蛋白條帶吸光度，計算蛋白相對表達水平。

1.2.4MTT試劑盒檢測細胞存活率 各組細胞培養48 h時，按試劑盒說明操作，檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，用結合緩沖液重懸，按照試劑盒說明書，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 侵襲實驗：用基質膠包被Transwell小室上室，然后取200 μl細胞懸液種于其中，培養24 h，多聚甲醛固定后用0.1%結晶紫染色，顯微鏡觀察并隨機選取5個視野拍照并計數。遷移實驗：不用基質膠包被Transwell上室，其余同侵襲實驗步驟。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗 將LINC01446野生型和突變型熒光素酶表達載體分別與miR-con和miR-432-5p 共轉染至Hep3B細胞，按照說明書進行檢測。

1.2.8統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1LncRNA LINC01446和miR-432-5p在肝癌組織和肝癌細胞系中的表達 與癌旁組織相比，肝癌組織中LINC01446表達水平顯著升高，miR-432-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1；與正常肝細胞THLE-2相比，肝癌細胞MHCC97L、Hep3B、Huh7、HCCLM3中LINC01446表達水平顯著升高，miR-432-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。見表2。可見，肝癌組織和肝癌細胞系中LINC01446高表達，miR-432-5p低表達。

表1 LncRNA LINC01446和miR-432-5p在肝癌組織和癌旁組織中的表達

表2 LncRNA LINC01446和miR-432-5p在肝癌細胞系和正常肝細胞中的表達

2.2沉默LINC01446抑制肝癌細胞Hep3B存活和誘導細胞凋亡 與si-con組相比，si-LINC01446組LINC01446表達水平顯著降低，Ki67表達水平和細胞存活率顯著降低，Cleaved caspase-3表達水平和細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖1、表3、圖2。

圖1 流式細胞術檢測肝癌細胞凋亡率

表3 沉默LINC01446抑制肝癌細胞Hep3B存活、遷移、侵襲、凋亡和轉移相關蛋白表達

圖2 Western印跡檢測Ki67和Cleaved caspase-3蛋白表達

2.3沉默LINC01446抑制肝癌細胞Hep3B遷移和侵襲 與si-con組相比，si-LINC01446組MMP-2、MMP-9表達水平及Hep3B細胞給遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)。見表3、圖3、圖4。

圖3 Transwell檢測肝癌細胞遷移(結晶紫染色，×200)

圖4 Western印跡檢測MMP-2和MMP-9表達

2.4LINC01446靶向調控miR-432-5p表達 StarBase預測顯示LINC01446與miR-432-5p存在結合位點(圖5)。miR-432-5p與WT-LINC01446共轉染的Hep3B細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)(表4)。si-LINC01446組miR-432-5p表達水平顯著高于si-con組(4.19±0.35 vs 1.00±0.11,P<0.05)；pcDNA-LINC01446組miR-432-5p表達水平顯著低于pcDNA組(0.39±0.06 vs 0.96±0.09；P<0.05)。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖5 LINC01446與miR-432-5p互補的核苷酸序列

2.5miR-432-5p抑制肝癌細胞增殖、轉移、侵襲和誘導細胞凋亡 與miR-con組相比，miR-432-5p組MMP-2、MMP-9表達水平和遷移、侵襲數量顯著降低，Ki67表達水平和細胞存活率顯著降低，Cleaved caspase-3表達水平和細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖6、表5。

圖6 Western印跡檢測Ki67、Cleaved caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達

表5 miR-432-5p抑制肝癌細胞增殖、轉移、侵襲和誘導細胞凋亡

2.6干擾miR-432-5p部分逆轉沉默LINC01446抑制肝癌細胞增殖、轉移、侵襲和誘導細胞凋亡的作用 與si-LINC01446+anti-miR-con組相比，si-LINC01446+anti-miR-432-5p組miR-432-5p表達水平顯著降低，Ki67表達水平和細胞存活率顯著升高，MMP-2、MMP-9表達水平和遷移、侵襲細胞數顯著升高，Cleaved caspase-3表達水平和細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖7，表6。

表6 干擾miR-432-5p部分逆轉沉默LINC01446抑制肝癌細胞增殖、轉移、侵襲和誘導細胞凋亡的作用

2.7LINC01446調控miR-432-5p表達影響肝癌細胞Wnt信號通路 與si-con組相比，si-LINC01446組β-catenin、c-myc表達水平顯著降低，GSK-3β表達水平顯著升高(P<0.05)；與si-LINC01446+anti-miR-con組相比，si-LINC01446+anti-miR-432-5p組β-catenin、c-myc表達水平顯著升高，GSK-3β表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖8，表7。可見，沉默LINC01446抑制Wnt信號通路的激活，而干擾miR-432-5p部分逆轉沉默LINC01446對Wnt信號通路的抑制作用。

1～4：si-con組，si-LINCO1446組，si-LINC01446+anti-miR-con組，si-LINCO1446+anti-miR-432-5p組；圖8同圖7 Western印跡檢測Ki67、Cleaved caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達

圖8 Western印跡檢測β-catenin、c-myc和GSK-3β蛋白表達

表7 干擾miR-432-5p和沉默LINC01446對肝癌細胞Wnt信號通路的影響

3 討 論

肝癌是預后較差的惡性腫瘤，靶向治療是中晚期治療的新方法，尋找更多肝癌相關的特異性靶點對臨床肝癌的靶向治療具有重要意義〔8〕。研究發現LncRNA參與肝癌的發生發展過程，與肝癌的發生、轉移、凋亡有關〔9〕。如沉默LncRNA核富含豐富的轉錄本(NEAT)1表達可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲〔10〕。有研究報道LncRNA LINC01446中的單核苷酸多態性(SNP)與放線菌的相對豐度相關，而放線菌與炎癥性腸病相關〔11〕。LncRNA LINC01446通過調節miR-489-3p促進膠質母細胞瘤的進展〔4〕。本實驗結果顯示，在肝癌組織和肝癌細胞中LINC01446高表達，沉默LINC01446后，細胞存活率和遷移、侵襲細胞數顯著降低，而細胞凋亡率顯著升高，且Ki67、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，Cleaved caspase-3表達水平顯著升高。Ki67是DNA合成相關酶，其表達水平的高低可以用以判斷細胞增殖活性，研究發現Ki67在肝癌患者中高表達，影響患者預后〔12〕。MMP-2、MMP-9均屬于MMP家族，與細胞遷移和侵襲相關，上調MMP-2/MMP-9，促進肝癌細胞侵襲和轉移〔13〕。Cleaved caspase-3是細胞凋亡相關蛋白，激活caspase-3活化為Cleaved caspase-3可促進細胞凋亡〔14〕。本實驗結果說明沉默LINC01446可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進肝癌細胞凋亡。

研究發現miRNA與腫瘤細胞增殖、轉移及復發密切相關，通過調控miRNA的表達可抑制腫瘤的進展〔15〕。有研究報道過表達circ_001569通過調控miR-411-5p和miR-432-5p促進肝癌細胞的生長，遷移和侵襲〔16〕。hsa_circ_0008039通過調節miR-432-5p促進乳腺癌細胞增殖和遷移〔17〕。本實驗結果說明過表達miR-432-5p可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進肝癌細胞凋亡。且本實驗還發現，LINC01446靶向調控miR-432-5p，干擾miR-432-5p部分逆轉了沉默LINC01446對Hep3B細胞的作用。提示，LINC01446可能通過調控miR-432-5p影響肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。

Wnt/β-catenin信號通路是Wnt的經典信號通路，研究發現Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與肝癌的發生發展密切相關，研究肝癌中Wnt/β-catenin信號通路的作用機制可為其作為靶點用于肝癌的臨床治療提供理論依據〔18〕。β-catenin的異常表達可以激活Wnt/β-catenin信號通路，c-myc是一種癌基因，也是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因，有研究表明SNHG16通過Wnt/β-catenin信號通路促進肝癌細胞的增殖和遷移〔19〕。GSK-3β是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵調節因子，GSK-3β能磷酸化β-catenin使其降解，抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活〔20〕。人參皂苷Rh2通過激活GSK-3β，降解β-catenin抑制肝癌的轉移〔21〕。本實驗結果說明沉默LINC01446抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。而干擾miR-432-5p部分逆轉沉默LINC01446對Wnt信號通路的抑制作用。提示，LINC01446可能通過調控miR-432-5p影響Wnt/β-catenin信號通路的激活。

綜上所述，沉默LINC01446可通過調控miR-432-5p和Wnt信號通路抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。