二甲雙胍對宮頸癌干細胞增殖及放化療敏感性的影響

郭倩 任倩梅 毛熙光 詹平

(西南醫科大學附屬醫院婦科，四川 瀘州 646000)

30%～50%的宮頸癌患者在治療結束后的3～5年內復發和轉移，主要原因是放療和化療抵抗〔1，2〕。宮頸癌產生放療和化療抵抗的根源是宮頸癌干細胞的存在，宮頸癌干細胞是腫瘤轉移的主要原因之一，也是腫瘤預后不良的重要因素〔3〕。宮頸癌干細胞是腫瘤組織中具備干細胞特性的極少量細胞，具有自我更新和多向分化潛能，并表達干細胞的表面標志物，其數量在手術及放化療后反而增多，出現富集現象〔4〕。Chhabra〔5〕的研究發現發生放療抵抗的宮頸癌細胞具有腫瘤干細胞特性，具有較強的裸鼠移植瘤形成能力和克隆形成能力，同時表達Oct4、CD24和CD44等腫瘤干細胞表面標志物。Liu等〔6〕在探討宮頸癌放療抵抗機制時發現，放療誘導宮頸癌細胞發生上皮間質化是導致宮頸癌干細胞增多的重要原因。因此，提高宮頸癌干細胞放療敏感性的治療是改善宮頸癌愈后的關鍵措施。二甲雙胍是被廣泛應用于臨床治療糖尿病的首選藥物〔7〕。服用二甲雙胍的糖尿病患者的腫瘤發病率低于應用其他藥物治療糖尿病的患者〔8〕。二甲雙胍不僅對肝癌、腎癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、前列腺癌及宮頸癌細胞具有增殖抑制和凋亡誘導作用〔9，10〕，還對結腸癌干細胞、神經膠質瘤干細胞、胃癌干細胞、胰腺癌干細胞、肝癌干細胞、乳腺癌干細胞及骨肉瘤干細胞的增殖具有抑制作用〔11〕。也有研究證實二甲雙胍不僅提高乳腺癌、食管癌、宮頸癌、子宮內膜癌、肝癌、卵巢癌及肺癌的化療敏感性〔12〕，還能提高食管癌、結直腸癌、肺癌及胰腺癌細胞的放療敏感性〔13〕。目前，尚未見到二甲雙胍對宮頸癌干細胞的增殖及放化療敏感性的相關報導。因此，本研究應用常規方法從宮頸癌細胞中分選出宮頸癌干細胞，鑒定后進行體外培養，觀察二甲雙胍對宮頸癌干細胞增殖活性和放化療敏感性的影響，為提高治療宮頸癌的療效和改善患者愈后提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人宮頸鱗癌SiHa細胞株，購買于中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.1.2主要試劑與儀器 二甲雙胍、順鉑、噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、二甲基亞砜(DMSO)、胰島素、碘化丙啶(Sigma-Aldrich公司)；RPMI1640培養基、DMEM/F12培養基、胎牛血清、重組人表皮生長因子、成纖維細胞生長因子(Gibco公司)；CD24-FITC單克隆抗體、CD24同型對照、CD44-PE單克隆抗體、CD44同型對照(BD Pharmagen公司)；兔抗人CD133、Oct4、Nanog、性別決定基因相關轉錄因子(Sox)-2、β-actin單克隆抗體(Abcam公司)；Alexa Fluor?594標記的山羊抗兔IgG(Thermo公司)；Accutase?細胞消化液(嘉美生物技術公司)；超凈工作臺、CO2培養箱、全自動酶標儀(Thermo公司)；熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡(Olympus公司)；電泳儀、電轉槽、凝膠成像系統(Bio-Rad公司)；低溫細胞離心機(StatSpin公司)。

1.2實驗方法

1.2.1人宮頸鱗癌SiHa細胞的培養 將裝有SiHa細胞的凍存管從液氮罐中取出，在37℃水浴箱中快速融化成液態，將復蘇的SiHa細胞以1×104個/ml的濃度接種到培養瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基5 ml，置入37℃、5%CO2培養箱中培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，待大部分細胞貼壁后首次換液，培養至貼壁細胞達到80%融合后，進行傳代。

1.2.2宮頸癌干細胞的分選 根據Chopra等〔14〕的方法，應用流式細胞儀分選CD44+/CD24+SiHa細胞進行懸浮培養富集宮頸癌干細胞。方法如下：收集第3代處于對數生長期的Siha細胞，PBS洗滌后加入0.25%胰蛋白酶溶液進行消化，倒置相差顯微鏡下觀察細胞變圓后，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基終止消化，制成單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，重懸細胞，以5×106個/ml的濃度接種到流式細胞檢測管中，隨后加入0.625 μl CD24-FITC單克隆抗體和CD44-PE單克隆抗體，同時設同型對照管，4℃避光孵育30 min，期間用一次性移液管吹打混勻3次，1 000 r/min離心5 min，用流式細胞術緩沖液重懸細胞，在流式細胞儀上分選CD44+/CD24+SiHa細胞，使細胞純度>95%。將分選出的CD44+/CD24+SiHa細胞以1×106個/ml的濃度接種到培養皿中，用腫瘤干細胞培養基(1 ml DMEM/F12加入10 ng成纖維細胞生長因子、20 ng重組人表皮生長因子、25 mg胰島素和4 ml胎牛血清)在37℃、5%CO2培養箱中懸浮培養，每日換液，7 d后細胞球形成，繼續培養7 d，細胞球結構變緊密后，按1∶3傳代，取第3代細胞球進行宮頸癌干細胞鑒定及實驗。

1.2.3宮頸癌干細胞的鑒定 參照Liu等〔15〕的方法，應用免疫熒光染色法檢測干細胞標記物CD133和Oct4的表達。取第3代的腫瘤細胞球，用Accutase細胞消化液孵育3 min，制成單細胞懸液，以1×107個/ml的濃度接種于事先置于一次性6孔培養板各孔中的蓋玻片上，用10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養24 h，取出貼有細胞的蓋玻片，4%多聚甲醛固定10 min，0.1% Triton X-100透膜3 min，10%山羊血清封閉45 min，滴加兔抗人CD133、Oct4單克隆抗體，4℃避光孵育，12 h后滴加熒光標記山羊抗兔IgG，避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4二甲雙胍最佳作用濃度與時間的篩選 取第3代宮頸癌干細胞懸液，以6×104個/L濃度接種于一次性96孔培養板的各孔內，以DMSO為空白組，每孔內細胞懸液體積為100 μl，37℃、5%CO2培養24 h，去除未貼壁細胞后，分別加入終濃度為5、10、20 mmol/L的二甲雙胍溶液，繼續培養24、48、72 h，不同濃度和作用時間分別設6個復孔，在不同時間點取出培養板，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，避光孵育4 h，隨后每孔加入DMSO溶液150 μl，室溫混勻10 min，在酶標儀上波長570 nm處檢測每孔的吸光度值(OD值)，根據公式：細胞存活率=(實驗組OD值-對照組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%計算各組宮頸癌干細胞的存活率。

1.2.5順鉑最佳作用濃度的篩選 取第3代宮頸癌干細胞懸液，以6×104個/L濃度接種于一次性96孔培養板的各孔內，以DMSO為空白組，每孔內細胞懸液體積為100 μl，37℃、5%CO2培養同1.2.4。

周恩來和郭沫若此時正在武漢組織紀念抗戰一周年群眾歌詠大會，得知桂濤聲和冼星海創作了這首《在太行山上》，便前往冼星海住所先睹為快。

1.2.6放療最佳作用劑量的篩選 取第3代宮頸癌干細胞懸液，以6×104個/L濃度接種于一次性96孔培養板的各孔內，以DMSO為空白組，每孔內細胞懸液體積為100 μl，37℃、5%CO2培養24 h，去除未貼壁細胞后，分別用2、4、8、16 Gy的60-鈷γ射線照射24、48、72 h，不同劑量和作用時間分別設6個復孔，在不同時間點取出培養板，后續培養同1.2.4。

1.2.7實驗分組與細胞干預 取第3代宮頸癌干細胞制成細胞懸液，分別接種于不同培養瓶中，隨機分為6組：①對照組：不做任何處理的宮頸癌干細胞；②二甲雙胍組：用20 mmol/L二甲雙胍處理細胞72 h；③放療組：用8 Gy的60-鈷γ射線照射72 h；④二甲雙胍+放療組：用20 mmol/L二甲雙胍處理細胞的同時用8 Gy的60-鈷γ射線照射，共72 h；⑤化療組：用20 nmol/L順鉑處理細胞72 h；⑥二甲雙胍+化療組：同時用20 mmol/L 二甲雙胍和20 nmol/L順鉑處理細胞72 h。每組3瓶。

1.2.8MTT法檢測宮頸癌干細胞的存活率 取各組細胞制成細胞懸液，以6×104個/L濃度接種于一次性96孔板的各孔內，以DMSO為空白組，每組6個復孔，每孔內細胞懸液體積為100 μl，37℃、5%CO2培養24 h，去除未貼壁細胞，后續培養同1.2.4。

1.2.9流式細胞術檢測二甲雙胍對胃癌干細胞凋亡的影響 取各組細胞制成細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，收集細胞至流式專用離心管中，每管內加入70%乙醇1 ml，4℃固定24 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS懸浮細胞懸浮，向每管內加入0.5 ml碘化丙啶，37℃避光染色30 min，在流式細胞儀上波長488 nm處檢測細胞凋亡率。

1.2.10Western印跡檢測各組宮頸癌干細胞Nanog和Sox-2的表達 收集各組細胞，用全細胞裂解液裂解細胞，10 000 r/min離心3 min，取上清液，考馬斯亮藍法檢測試提取蛋白樣品濃度，煮沸法使樣品變性，10%凝膠電泳、轉膜、3%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，加入兔抗人Nanog、Sox-2單克隆抗體，4℃孵育12 h，隨后用山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，應用化學發光法在凝膠成像系統中顯色，以β-actin為內參考，用Quantiy One軟件測量條帶灰度，以目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值來半定量目的蛋白。

1.3統計學分析 應用GraphPad Prism 6.0軟件進行實驗數據的統計學分析與繪圖，計量數據采用均數±標準差表示，組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1宮頸癌干細胞的鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察，培養1 d，SiHa細胞呈球形懸浮于培養基中；培養7 d后，細胞聚集生長，形成球狀細胞團，結構較松散；培養14 d后，腫瘤細胞球體積增大，細胞排列緊密，界限不清，即出現腫瘤干細胞富集。免疫熒光染色結果顯示，腫瘤球中的細胞表達CD133(綠色熒光)和Oct4(紅色熒光)。見圖1。

圖1 宮頸癌干細胞的鑒定(免疫熒光染色，×400)

2.2二甲雙胍最佳作用濃度與時間的篩選 MTT檢測結果顯示，隨著二甲雙胍作用濃度的升高和作用時間的延長，宮頸癌干細胞的存活率呈下降趨勢；作用24 h，20 mmol/L濃度組細胞存活率低于0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L濃度組，但差異無統計學意義(P>0.05)；作用48和72 h，10 mmol/L和20 mmol/L濃度組細胞存活率顯著低于0 mmol/L和5 mmol/L濃度組(P<0.05)；10 mmol/L和20 mmol/L濃度組作用48 h和72 h，細胞存活率顯著低于作用24 h (P<0.05)；10 mmol/L和20 mmol/L濃度組作用72 h，細胞存活率顯著低于作用48 h(P<0.05)。見表1。

表1 二甲雙胍對宮頸癌干細胞存活率的影響

2.3順鉑最佳作用濃度的篩選 MTT檢測結果顯示，作用48 h和72 h后，20 nmol/L和40 nmol/L濃度組細胞存活率顯著低于0 nmol/L和10 nmol/L濃度組(P<0.05)；10 nmol/L濃度組作用72 h，細胞存活率顯著低于作用24 h (P<0.05)；20 nmol/L和40 nmol/L濃度組作用48 h和72 h，細胞存活率顯著低于作用24 h (P<0.05)。見表2。

表2 順鉑對宮頸癌干細胞存活率的影響

2.4放療最佳作用劑量的篩選 MTT檢測結果顯示，作用48 h和72 h后，8、16 Gy劑量組細胞存活率顯著低于0、4 Gy劑量組(P<0.05)；8、16 Gy劑量組作用48 h和72 h，細胞存活率顯著低于作用24 h(P<0.05)。見表3。

表3 放療對宮頸癌干細胞存活率的影響

2.5二甲雙胍對各組宮頸癌干細胞增殖的影響 MTT檢測結果顯示，二甲雙胍組、放療組、二甲雙胍+放療組、化療組、二甲雙胍+化療組細胞均顯著低于對照組(P<0.05)；二甲雙胍+放療組、二甲雙胍+化療組細胞存活率顯著低于二甲雙胍組和放療組(P<0.05)；二甲雙胍+化療組細胞存活率顯著低于化療組(P<0.05)。見表4。

表4 二甲雙胍對各組宮頸癌干細胞增殖和凋亡的影響

2.6二甲雙胍對各組宮頸癌干細胞凋亡的影響 流式檢測結果顯示，二甲雙胍組、放療組、二甲雙胍+放療組、化療組、二甲雙胍+化療組細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)；二甲雙胍+放療組、二甲雙胍+化療組細胞凋亡率顯著高于二甲雙胍組和放療組(P<0.05)；二甲雙胍+化療組細胞凋亡率顯著高于化療組(P<0.05)。見表4。

2.7二甲雙胍對宮頸癌干細胞中Nanog表達的影響 Western印跡檢測結果顯示，各組細胞中Nanog蛋白的陽性表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖2。

1～6：對照組、二甲雙胍組、放療組、二甲雙胍+放療組、化療組、二甲雙胍+化療組圖2 Western印跡檢測Nanog表達

3 討 論

針對宮頸癌干細胞的治療有望解決宮頸癌的放化療抵抗問題。近年來，雖然對宮頸癌干細胞的生物學特性和表面標志物等方面有了較深入的研究，但宮頸癌腫瘤干細胞的放化療抵抗和自我更新機制尚未完全明確，應用化合物有效控制宮頸癌干細胞生長的研究不多〔16〕。Nayak等〔17〕應用小分子化合物體外處理宮頸癌干細胞可提高該細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。Yokoi等〔18〕的研究發現一種選擇性的轉錄活性抑制劑可有效清除宮頸癌干細胞。Bigoni-Ordóez等〔19〕的研究則發現碘可以降低宮頸癌干細胞表面標志物的表達，從而減弱腫瘤干細胞的自我增殖能力。張燕華等〔20〕的研究發現，姜黃素抑制宮頸癌干細胞的增殖與聚集并提高其化療敏感性。王雪莉等〔21〕研究證實，紫花牡荊素可抑制宮頸癌干細胞的增殖。以上對所應用藥物的研究均處于基礎體外實驗階段，與臨床相距甚遠。于是，本研究把著眼點放在了臨床常用藥上，也為老藥新用開辟新思路。二甲雙胍是具有良好耐受性的抗腫瘤藥物〔22〕。臨床試驗已展開二甲雙胍對卵巢癌、乳腺癌、結直腸癌和胰腺癌等的治療〔23〕。本研究通過二甲雙胍體外干預宮頸癌干細胞也觀察到二甲雙胍具有抑制宮頸癌干細胞增殖及和提高放化療敏感性的作用。

王華等〔24〕的研究證實，宮頸癌干細胞是人宮頸癌SiHa細胞株對順鉑產生耐藥的主要機制之一。Gu等〔25〕、Zhang等〔26〕、Yang等〔27〕和Wu等〔28〕的研究均證實，CD24+/CD44+可作為宮頸癌干細胞的表面標志物。Oct4是一種常見的干細胞相關基因，作為重要的轉錄因子在干細胞抗凋亡的過程中發揮重要的作用〔29〕。本研究免疫熒光染色結果提示所分選的宮頸癌干細胞可用于本實驗。本研究MTT結果提示二甲雙胍對宮頸癌干細胞增殖的抑制作用呈時間與劑量依賴性。為了確定放療劑量與順鉑作用濃度，本研究分別應用梯度放療劑量和順鉑濃度作用于宮頸癌干細胞，MTT結果顯示宮頸癌干細胞的存活率對放療和化療沒有明顯的時間和劑量依賴性。以上結果與等Kwon等〔30〕和Tyagi等〔31〕的研究結果一致，兩項研究均證實宮頸癌干細胞具有放療和化療抵抗的特性。

臨床上普遍認為宮頸癌放療與化療失敗的主要原因是局部腫瘤增殖不受控制或遠處轉移，且宮頸癌根治術后經放化療復發的患者再次接受放療時療效較差，以上情況均與放化療抵抗有關，而腫瘤干細胞可能是其根源〔32，33〕。本研究細胞存活和凋亡結果說明二甲雙胍可能具有放療和化療協同效應，可提高宮頸癌干細胞對輻射和順鉑的敏感性。腫瘤細胞來源于腫瘤干細胞，腫瘤干細胞的干性是腫瘤生長、侵襲、轉移及復發的主要原因。王華等〔34〕的研究顯示，Oct3/4可通過上調腫瘤干細胞自我更新的關鍵性基因Nanog來維持腫瘤干細胞的干性。Nanog是特異性表達于胚胎干細胞中的基因，在維持干細胞的自我更新和亞全能性方面發揮關鍵性作用，也是細胞全能性或多能性的標志物〔35，36〕。本研究Western印跡檢測結果說明二甲雙胍可能不能改變宮頸癌干細胞的干性。

綜上所述，二甲雙胍具有抑制宮頸癌干細胞增殖的作用，并可提高宮頸癌干細胞對放療或化療的敏感性，但不影響宮頸癌干細胞的干性。宮頸癌干細胞可能成為二甲雙胍的又一治療靶細胞，為二甲雙胍在放化療增敏的臨床應用提供了實驗依據。