MicroRNA-129-5p在糖尿病性心肌病中的作用

孔德憶 孔霄

(1韓國嘉泉大學，韓國 首爾 13120；2曲阜市人民醫院心內科)

糖尿病性心肌病是糖尿病的主要心血管并發癥，其特征是心肌纖維化、心室重構和心臟功能障礙。線粒體功能障礙、氧化應激、炎癥、鈣處理受損、腎素-血管緊張素系統活化及心肌細胞凋亡均與糖尿病性心肌病的發病機制有關〔1，2〕。微小RNA(miRNAs)是一組由19～25個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，通過對蛋白質編碼基因的轉錄后修飾進行調節，從而抑制miRNA的翻譯或促進其降解，進而調節基因表達。研究表明，miRNAs在糖尿病性心肌病的生物學進程中發揮重要作用。miR-206-3p在高糖誘導下表達上調，并通過靶向下調LXRα的表達促進高糖介導的心肌細胞凋亡〔3〕；miR-146可能通過調節IRAK1介導的炎癥反應參與糖尿病心肌損傷的發生發展〔4〕。然而，miR-129-5p在糖尿病性心肌病發病中的作用及機制還有待進一步探究。本文旨在探究miR-129-5p在高糖誘導的H9C2心肌細胞中的表達及作用，為糖尿病合并心血管并發癥的診斷和治療提供相關的理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料 人H9C2心肌細胞購自上海生物科學研究所。主要試劑及儀器：10%胎牛血清(FBS)、DMEM培養基均購自美國Gibco公司。miR-129-5p模擬物及其陰性對照物均購自上海GenePharma公司。Lipofectamine?2000、TRIzol試劑和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自美國Invitrogen公司。PCR試劑盒和基因引物均購自Takara生物有限公司。CCK-8試劑盒購于愛必信(上海)生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。Ki67、Bax、酶切-caspase-3、β-actin和二抗均購于英國Abcam公司，伯樂流式細胞儀ZE5購于伯樂生命醫學產品(上海)有限公司(bio-rad)。多功能酶標儀PerkinElmer EnVision購于珀金埃爾默企業管理(上海)有限公司 。

1.2細胞培養與轉染分組 將H9C2心肌細胞置于含有10% FBS的DMEM培養基中，并在37℃、5% CO2條件下的細胞培養箱中進行培養。取對數生長期的H9C2心肌細胞接種于6孔板中，繼續培養24 h。采用5.5 mmol/L葡萄糖(對照組)或50.0 mmol/L葡萄糖(高糖組)干預H9C2心肌細胞96 h。最后，按照制造商的說明，使用脂質體Lipofectamine?2000將miR-129-5p模擬物(HG+miR-129-5p模擬物組)及其陰性對照物(HG+mimics-NC組)轉染至H9C2心肌細胞中。

1.3qRT-PCR法檢測miR-129-5p的表達水平〔4〕對照組和高糖組干預H9C2心肌細胞不同時間(0、24、48、72、96 h)后，采用實時熒光聚合鏈式反應(qRT-PCR)檢測H9C2心肌細胞中miR-129-5p的相對表達水平。根據制造商說明，使用TRIzol試劑盒提取H9C2心肌細胞中的總RNA，并采用紫外分光光度法檢測RNA濃度和純度，進而合成互補DNA。使用SYBR Premix-Ex-Taq試劑盒進行qRT-PCR反應。以U6為內參，miR-129-5p上游引物：5′-ACACTCCTTTTTGCGTCTGGGCTTGC-3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.4ELISA檢測白細胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α含量〔5〕采用ELISA檢測過表達miR-129-5p對H9C2心肌細胞上清液中炎癥細胞因子IL-1β和TNF-α的表達水平。取轉染后的H9C2心肌細胞接種于6孔板中，每組設置3個復孔，培養48 h后，收集細胞，于4℃，1 000 r/min離心10 min，取細胞上清液。按照制造商的說明書，應用IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒分別檢測細胞上清液中IL-1β和TNF-α的含量。

1.5氧化應激標志物超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的測量〔6〕H9C2心肌細胞轉染24 h后，按照制造商說明書，應用SOD和MDA試劑盒分別測定H9C2心肌細胞上清液中SOD和MDA的含量。

1.6CCK-8檢測各組細胞存活率 收集各組心肌細胞，并接種于96孔板中，接種密度為2×103個細胞/孔，在培養箱中培養48 h后每孔加入CCK-8試劑(10 μl)，繼續培養2 h后在酶標儀上于波長為450 nm處檢測吸光值。

1.7流式細胞術檢測H9C2心肌細胞的凋亡〔7〕采用流式細胞術檢測過表達miR-129-5p對H9C2心肌細胞凋亡的影響。細胞轉染24 h后，用胰酶消化并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，將H9C2心肌細胞懸浮在100 μl上樣緩沖液中，并加入5 μl Annexin V-FITC，然后在黑暗中于室溫孵育15 min。隨后，添加5 μl PI后，將細胞在室溫下黑暗中孵育15 min。最后，按照試劑盒說明書，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8免疫印跡檢測各組細胞中相關蛋白的表達 收集轉染后的各組心肌細胞，加入裂解液裂解細胞后提取總蛋白，并對蛋白進行檢測，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后進行轉膜、封閉，洗膜后分別加入稀釋的Ki67(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、酶切-caspase-3(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗，培養過夜后(4℃)，加入二抗(1∶2 000)，培養2 h后進行顯影和拍照。

1.9統計分析方法 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1兩組miR-129-5p表達比較 與對照組相比，高糖組各時點H9C2心肌細胞中miR-129-5p表達顯著下調(P<0.05，P<0.01,P<0.001)，且呈時間依賴關系，見表1。

表1 兩組不同時間H9C2心肌細胞中miR-129-5p相對表達比較

2.2各組心肌細胞炎癥和氧化應激反應比較 與對照組相比，高糖組H9C2心肌細胞中IL-1β、TNF-α和MDA相對含量顯著升高(P<0.01)，而SOD相對含量顯著降低(P<0.01)；與高糖+mimics-NC組相比，高糖+miR-129-5p模擬物組H9C2心肌細胞中IL-1β、TNF-α和MDA相對含量顯著降低(P<0.05,P<0.01)，而SOD相對含量顯著升高(P<0.01)，見表2。

表2 各組IL-1β、TNF-α、SOD和MDA相對含量及細胞增殖和凋亡相關蛋白表達比較

2.3各組心肌細胞存活率比較 與對照組〔(100.00±6.78)%〕相比，高糖組H9C2細胞存活率〔(43.42±5.67)%〕顯著降低(P<0.001)，與高糖+mimics-NC組〔(46.39±5.11)%〕相比，高糖+miR-129-5p模擬物組中H9C2心肌細胞存活率〔(79.68±8.67)%〕顯著增加(P<0.001)。

2.4各組H9C2心肌細胞凋亡比較 與對照組〔(5.71±0.54)%〕相比，高糖組H9C2心肌細胞凋亡率〔(22.56±2.18)%〕顯著升高(P<0.001)；與高糖+mimics-NC組〔(19.32±1.86)%〕相比，高糖+miR-129-5p模擬物組中H9C2心肌細胞凋亡率〔(7.27±0.68)%〕顯著降低(P<0.001)，見圖1。

圖1 流式細胞術檢測高糖環境下H9C2心肌細胞的凋亡

2.5各組H9C2心肌細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較 與對照組相比，高糖組Ki67蛋白表達量顯著降低(P<0.01)，而Bax和酶切-caspase-3蛋白表達顯著增加(P<0.01)；與高糖+mimics-NC組相比，高糖+miR-129-5p mimics組Ki67蛋白表達量顯著增加(P<0.01)，而Bax和酶切-caspase-3蛋白表達顯著減少(P<0.01)。見表2，圖2。

1～4：對照組、高糖組、高糖+mimics-NC組、高糖+miR-129-5p mimics組圖2 各組細胞增殖和凋亡相關蛋白表達

3 討 論

糖尿病性心肌病是糖尿病患者的重要心血管并發癥，可導致心力衰竭、心律不齊和猝死，是糖尿病患者死亡的主要原因〔8，9〕。然而糖尿病性心肌病的診斷和治療受到限制。miRNA在許多生物過程中都起重要作用，包括心血管疾病、糖尿病和相關并發癥〔10～12〕。有研究發現miR-6216在缺氧/復氧誘導的H9C2心肌細胞中表達上調，敲低miR-6216表達可減輕缺氧/復氧誘導的H9C2心肌細胞損傷〔13〕；姜輝等〔14〕也在研究中發現敲低miR-633可通過調節AKT的活性顯著促進缺氧誘導的H9C2心肌細胞增殖和遷移，從而促進心肌梗死進程。研究報道，miR-129-5p在多種疾病中均差異表達，參與調控多個疾病的發生和發展〔15，16〕，然而miR-129-5p在糖尿病性心肌病中的作用還不清楚。

本研究結果證明了miR-129-5p在高糖干預的H9C2心肌細胞中的表達下調。過表達miR-129-5p可在體外減少高糖誘導的H9C2心肌細胞的炎癥反應、氧化應激。同時發現過表達miR-129-5p可顯著削弱高糖對H9C2心肌細胞的存活率及Ki67蛋白表達水平的抑制作用，另外，流式細胞術分析發現過表達miR-129-5p減輕了高糖誘導的H9C2心肌細胞的凋亡，并減少了高糖誘導的Bax和酶切-caspase-3蛋白表達水平。

綜上，在高糖環境下miR-129-5p的表達顯著下調，過表達miR-129-5p抑制高糖干預的H9C2心肌細胞的炎癥反應、氧化應激及凋亡，并促進了高糖抑制的細胞增殖。提示miR-129-5p具有預防糖尿病心肌病的潛力，并為后續相關研究進一步提供了理論基礎。