過表達(dá)miR-146b-3p通過靶向調(diào)控PCSK9表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

陳艷芳 賈賀 李富慧 黃景賀

(1南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽 473000；2鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年病科)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種發(fā)病率和死亡率都較高的慢性血管性疾病，脂質(zhì)代謝障礙是其病變的基礎(chǔ)，動(dòng)脈壁變厚、血管腔變窄，最終導(dǎo)致組織缺血或壞死，隨著治療方法的改進(jìn)，患者病死率略有下降，但死亡總數(shù)仍不斷上升〔1,2〕。研究氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)損傷修復(fù)的分子機(jī)制，為AS靶向治療提供理論基礎(chǔ)。 研究表明，miR-146b-3p 在高糖誘導(dǎo)的HUVECs中〔3〕、缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)〔4〕和糖尿病性腦梗死患者〔5〕中均表達(dá)下降，藥物利拉魯肽可能通過上調(diào)miR-146b-3p 表達(dá)改善炎癥和血管內(nèi)皮功能。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素(PCSK)9可能是miR-146b-3p的下游靶基因。oxLDL、高脂血癥和心肌缺血再灌注損傷均能上調(diào)PCSK9 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)，誘導(dǎo)HUVECs、apoE (-/-)小鼠海馬神經(jīng)元或心肌細(xì)胞凋亡〔6～8〕。但miR-146b-3p在oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷中的表達(dá)和影響及其是否靶向調(diào)控PCSK9影響oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷目前還尚未可知。本研究旨在探討過表達(dá)miR-146b-3p通過靶向調(diào)控PCSK9表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 HUVECs購自北京北納生物；胎牛血清(FBS)、F-12培養(yǎng)基和內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(ECGS)購自美國Gibco公司，胰蛋白酶和肝素購自Sigma-Aldrich公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購自美國Promega公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒〔RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)〕、實(shí)時(shí)熒光定PCR試劑盒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；引物、miR-146b-3p mimics(miR-146b-3p)、抑制劑(anti-miR-146b-3p)、PCSK9過表達(dá)載體(pcDNA-PCSK9)、PCSK9干擾物(si-PCSK9)、空載體和對(duì)照物(pcDNA、miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)及PCSK9突變型和野生型雙熒光素酶載體購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；PCSK9抗體、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3抗體和抗GAPDH抗體購自英國Abcam公司；雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司；流式細(xì)胞儀購自BD公司，發(fā)光儀、光學(xué)顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀及實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Bio-rad公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HUVECs在含有10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的F-12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)添加0.1 mg/ml肝素和0.05 mg/ml ECGS，培養(yǎng)條件：飽和濕度、37℃ 5% CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期，消化傳代。

1.2.2細(xì)胞oxLDL模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組 oxLDL模型建立：根據(jù)文獻(xiàn)〔9〕對(duì)HUVECs進(jìn)行oxLDL模型的建立，用培養(yǎng)液將對(duì)數(shù)生長期的HUVECs稀釋為5×104個(gè)/ml，接種于6孔板，細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)每孔加入100 μg/ml oxLDL培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組 轉(zhuǎn)染前24 h進(jìn)行HUVECs的接種和培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至融合度為80%時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將miR-NC、miR-146b-3p mimics、si-NC、si-PCSK9、anti-miR-NC、anti-miR-146b-3p、miR-146b-3p mimics與pcDNA、miR-146b-3p mimics與pcDNA-PCSK9分別轉(zhuǎn)染HUVECs。轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。實(shí)驗(yàn)分組：未處理的HUVECs記為對(duì)照(Con)組；用100 μg/ml oxLDL孵育HUVECs 24 h記為oxLDL組；用100 μg/ml oxLDL分別孵育轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-146b-3p mimics、轉(zhuǎn)染si-NC、轉(zhuǎn)染si-PCSK9、轉(zhuǎn)染miR-146b-3p mimics與pcDNA、轉(zhuǎn)染miR-146b-3p mimics與pcDNA-PCSK9的HUVECs 24 h，分別記為oxLDL+miR-NC組、oxLDL+miR-146b-3p組、oxLDL+si-NC組、oxLDL+si-PCSK9組、oxLDL+miR-146b-3p+pcDNA組、oxLDL+miR-146b-3p+pcDNA-PCSK9組。轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-146b-3p mimics、轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、轉(zhuǎn)染anti-miR-146b-3p的HUVECs分別記為miR-NC組、miR-146b-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-146b-3p組。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測RNA的表達(dá) 收集oxLDL處理和(或)轉(zhuǎn)染過的HUVECs，用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，以RNA為模板按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，測定合成的cDNA的濃度和純度，以cDNA為模板按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的說明書進(jìn)行反應(yīng)合成miR-146b-3p和PCSK9 mRNA；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 2 min；94℃ 45 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率 將各組HUVECs接種于6孔板中(5×104個(gè)細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)24 h，收集并洗滌細(xì)胞2次，將細(xì)胞稀釋為1×105個(gè)/ml，取300 μl 1倍結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl碘化丙啶(PI)，室溫避光20 min，再加入200 μl 1倍結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.6檢測細(xì)胞中MDA、SOD和GSH-Px水平 收集各組HUVECs，按照MDA、SOD和GSH-Px試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD和GSH-Px的含量。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，接種HUVECs，培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，按照1.2.3進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的含有miR-146b-3p與PCSK9預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT-PCSK9)和突變型(MUT-PCSK9)雙熒光素酶報(bào)告載體，分別與miR-NC或miR-146b-3p共轉(zhuǎn)染HUVECs。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，室溫裂解細(xì)胞20 min，離心收集上清，加入熒光素酶底物，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，檢測相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.8Western印跡檢測PCSK9和凋亡相關(guān)蛋白 收集HUVECs，加入細(xì)胞裂解液室溫裂解20 min，4℃超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉2 h，加入一抗(PCSK9抗體 1∶1 000，Bcl-2抗體1∶2 000，Bax抗體 1∶1 000，酶切caspase3抗體1∶3 000，抗GAPDH抗體1∶4 000)，4℃過夜孵育，洗膜2次，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h，顯影，以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-146b-3p和PCSK9在oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs中的表達(dá) oxLDL組HUVECs中miR-146b-3p表達(dá)量顯著低于Con組(P<0.001)，PCSK9的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著高于Con組(P<0.001)，見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測PCSK9蛋白表達(dá)

表1 miR-146b-3p和PCSK9在oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs中的表達(dá)

2.2miR-146b-3p過表達(dá)減輕oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激的影響 oxLDL組HUVECs中miR-146b-3p表達(dá)顯著低于Con組(P<0.05)，MDA水平顯著高于Con組(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著低于Con組(P<0.05)；oxLDL+miR-146b-3p組HUVECs中miR-146b-3p表達(dá)顯著高于oxLDL+miR-NC組(P<0.05)，MDA水平顯著低于oxLDL+miR-NC組(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著高于oxLDL+miR-NC組(P<0.05)。見表2。

表2 miR-146b-3p過表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激的影響

2.3miR-146b-3p過表達(dá)抑制oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡 oxLDL組HUVECs凋亡率顯著高于Con組(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著低于Con組(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax和酶切caspase3表達(dá)顯著高于Con組(P<0.05)；oxLDL+miR-146b-3p組HUVECs凋亡率顯著低于oxLDL+miR-NC組(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著高于oxLDL+miR-NC組(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax和酶切caspase3表達(dá)顯著低于oxLDL+miR-NC組(P<0.05)。見圖2、圖3、表3。

表3 miR-146b-3p過表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響

1～4：Con組，oxLDL組，oxLDL+miR-NC組，oxLDL+miR-146b-3p組圖2 Western印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖3 miR-146b-3p過表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

2.4抑制PCSK9表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響 oxLDL+si-PCSK9組HUVECs中PCSK9表達(dá)量顯著低于oxLDL+si-NC組(P<0.05)，MDA水平顯著低于oxLDL+si-NC組(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著高于oxLDL+si-NC組(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著低于oxLDL+si-NC組(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)顯著高于oxLDL+si-NC組(P<0.05)，Bax表達(dá)顯著低于oxLDL+si-NC組(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 PCSK9和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 抑制PCSK9表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響

2.5miR-146b-3p靶向調(diào)控PCSK9的表達(dá) 通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PCSK9的3′UTR中含有與miR-146b-3p互補(bǔ)的序列，見圖5。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示，miR-146b-3p和WT-PCSK9共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性顯著低于miR-NC和WT-PCSK9共轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；miR-146b-3p和MUT-PCSK9共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性與miR-NC和MUT-PCSK9共轉(zhuǎn)染組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。miR-146b-3p組細(xì)胞PCSK9表達(dá)量(0.22±0.02)顯著低于miR-NC組(0.43±0.04，P<0.05)；anti-miR-146b-3p組細(xì)胞PCSK9表達(dá)量(0.89±0.08)顯著高于miR-NC組(0.41±0.04，P<0.05)，見圖6。

圖5 PCSK9的3′UTR中含有與miR-146b-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：miR-NC組，miR-146b-3p組，anti-miR-NC組，anti-miR-146b-3p組圖6 Western印跡檢測PCSK9蛋白表達(dá)

2.6PCSK9過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-146b-3p過表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷的作用 oxLDL+miR-146b-3p+pcDNA-PCSK9組HUVECs細(xì)胞PCSK9蛋白表達(dá)量、MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量顯著高于oxLDL+miR-146b-3p+pcDNA組(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于oxLDL+miR-146b-3p+pcDNA組(P<0.05)。見圖7、表6。

1～4：miR-NC組，miR-146b-3p組，miR-146b-3p+pcDNA組，miR-146b-3p+pcDNA-PCSK9組圖7 PCSK9和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 PCSK9過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-146b-3p過表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的作用

3 討 論

oxLDL的聚集和血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的損傷是AS發(fā)生的始動(dòng)因素，內(nèi)皮炎癥通路的激活可導(dǎo)致AS、敗血癥等血管疾病，miR-146a和miR-146b可被促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)，研究表明，miR-146負(fù)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，其可通過抑制促炎通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化，在AS中可能發(fā)揮重要作用〔10〕。miR-146b-5p在AS患者病灶中表達(dá)顯著上調(diào)，抑制miR-146b-5p可通過靶向TRAF6促進(jìn)AS相關(guān)泡沫細(xì)胞形成炎癥，提高泡沫細(xì)胞形成過程中的脂質(zhì)攝取〔11〕。血管生成素(Ang)-1可顯著減弱脂多糖(LPS)對(duì)HUVECs的炎癥反應(yīng)，上調(diào)細(xì)胞中miR-146b-5p的表達(dá)，但是對(duì)miR-146b-3p和miR-146a表達(dá)無影響〔12〕。miR-146b-3p在AS中的研究較少，有研究表明，miR-146b-3p在動(dòng)脈血栓性疾病中表達(dá)下降，受信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3調(diào)節(jié)，并通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)途徑影響下游靶基因COX-2表達(dá)〔13〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p在oxLDL誘導(dǎo)后的HUVECs中表達(dá)顯著下調(diào)，與前述研究結(jié)果一致〔13〕，過表達(dá)miR-146b-3p表達(dá)可減輕oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷并抑制細(xì)胞凋亡，說明miR-146b-3p在HUVECs氧化損傷中發(fā)揮作用，對(duì)AS具有重要調(diào)節(jié)作用。

PCSK9又稱神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶(NARC)-1，其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜表面低密度脂蛋白(LDL)受體影響血液中脂類代謝，參與AS的發(fā)展〔14〕。PCSK9抑制劑可降低血液中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，已被市場批準(zhǔn)用于防治AS等心血管疾病〔15,16〕。研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9缺乏可減少AS、載脂蛋白B分泌和內(nèi)皮功能障礙〔17〕。本研究發(fā)現(xiàn)PCSK9在oxLDL誘導(dǎo)后的HUVECs細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，抑制PCSK9表達(dá)可減輕oxLDL對(duì)HUVECs細(xì)胞的損傷，抑制細(xì)胞凋亡，與前述研究結(jié)果〔15,16〕一致，說明抑制PCSK9可抑制AS的進(jìn)展。