MiR-448在氧葡萄糖剝奪/再恢復誘導的神經母細胞瘤細胞損傷中的作用

矯淑芹 林愛慶 李雪婷

(煙臺市牟平區中醫醫院 1腦病科，山東 煙臺 264100；2心血管病科)

缺血性腦卒中將會導致局部腦組織及其功能的損害，其損害程度與缺血的時間長短有關〔1〕。因此，及時恢復腦組織的供血對缺血性腦卒中病人的恢復至關重要。但是再灌注可誘發神經元細胞的凋亡，引起神經元損傷。因此，預防再灌注引起的神經元損傷成為缺血性腦卒中研究領域的熱點之一。目前，再灌注引起的神經元損傷的機制尚未得到充分闡明，需要進一步尋找關鍵的調控因子，為臨床的治療和藥物研發提供分子靶點。

微小RNA(miRNAs)是一種長度為22個核苷酸左右的單鏈內源性的RNA分子〔2，3〕。研究發現，miRNAs在調控腦血管疾病的發生、發展及恢復中發揮重要的調控作用，是一種潛在的缺血性腦卒中治療靶點〔4～6〕。有研究發現，急性腦缺血小鼠恢復供血后3 h，血液中miR-448的表達量就達到峰值，說明miR-448可能在腦缺血再灌注過程中發揮重要的調控作用〔7〕。另外，降低miR-448的表達可降低缺血再灌注引起的脊髓神經元的凋亡〔8〕。盡管如此，尚無報道探討miR-448在腦缺血再灌注引起的神經元凋亡中的作用。本文擬通過構建氧葡萄糖剝奪/再恢復(OGDR)神經母細胞瘤細胞模型，分析miR-448在OGDR誘導的細胞凋亡的作用及潛在機制，探討miR-448在腦缺血再灌注引起的神經元細胞損傷中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1實驗材料及主要試劑 神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。Trizol和SYBR GREEN qPCR Super Mix購自Invitrogen。CCK8試劑盒和膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天。Western印跡一抗及二抗購自Abcam。miR-448抑制劑(inhibitor)及陰性對照(NC)由蘇州吉瑪基因合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養及傳代 SH-SY5Y細胞10%胎牛血清完全培養基中置于常氧條件下培養(培養箱參數設置：95%的空氣，5%的CO2，37℃)。傳代首先用0.25%胰酶室溫下消化1 min，并在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化，2～3 d傳代1 次。根據細胞的生長情況，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2細胞轉染及OGDR模型構建 細胞轉染：按照Lipo6000TM轉染試劑的說明進行操作。OGDR模型構建培養條件：待細胞貼壁后，將完全培養基換成Hank平衡鹽溶液(HBSS)，并置于缺氧培養箱中培養(培養箱參數設置：94%的N2，1%的O2和5%的CO2，37℃)；培養4 h后，將HBSS換成完全培養基，并在常氧條件下培養24 h。

1.2.3細胞分組 正常培養組：按照SH-SY5Y細胞正常培養條件培養。OGDR組：待細胞貼壁后，按照OGDR模型構建條件培養。轉染試劑+正常培養組(Ⅰ組)：添加轉染試劑后，按照SH-SY5Y細胞正常培養條件培養。NC預轉染+OGDR組(Ⅱ組)：使用轉染試劑轉染NC后24 h，按照OGDR模型構建條件培養。miR-448 inhibitor預轉染+OGDR組(Ⅲ組)：使用轉染試劑轉染miR-448 inhibitor后24 h，按照OGDR模型構建條件培養。

1.2.4熒光定量PCR 按照Trizol常規方法提取各組細胞的總RNA；經過去基因組和純度鑒定后，進行RNA濃度測定；按照miRNA莖環引物的說明，取1 μg 總RNA，使用M-MLV逆轉錄進行逆轉；按照SYBR GREEN qPCR Super Mix的說明進行PCR反應。使用U6小核RNA作為內參，按照2-ΔΔCt的方法計算miR-448的相對表達量。miR-448的正向引物和反向引物序列分別為5′ TCGGCAGGTTGCATATGTAGGA 3′和5′ CTCAACTGGTGTCGTGGA 3′。U6小核RNA的正向引物和反向引物序列分別為5′ CTCGCTTCGGCAGCACA 3′ 和5′ AAC GCTTCACGAATTTGCGT 3′。

1.2.5CCK8檢測 取對數期生長的細胞，接種在96孔板；按照細胞分組所述的方法進行細胞處理；待處理結束后，每孔加入10 μl CCK8溶液；培養箱內孵育4 h；用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數期生長的細胞，接種在6孔板；按照細胞分組所述的方法進行細胞處理；待處理結束后，胰酶消化細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，1 000 r/min，4℃離心5 min收集細胞。加入100 μl 1×結合緩沖液重懸細胞；加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色液，輕輕混勻；避光、室溫反應10～15 min；加入400 μl 1×結合緩沖液，混勻后放置于冰上，隨即流式細胞儀檢測，BD FACSDiva 8.0.1軟件分析實驗結果。

1.2.7Western印跡分析 取對數期生長的細胞，接種在6孔板；按照細胞分組所述的方法進行細胞處理；待處理結束后，加入RIPA裂解液提取總蛋白。根據蛋白濃度測定的結果，計算每孔的蛋白上樣量；每孔加入30 μg的總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白；半干法轉膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)；5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入稀釋好的二抗4℃孵育過夜；第2天，TBST緩沖液洗去多余的一抗，加入稀釋好的二抗，室溫孵育40 min后，TBST緩沖液洗去多余的二抗；暗室內，加入電化學發光(ECL)液，使用X-ray曝光。利用Image Pro-Plus6.0軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA)分析蛋白的相對表達量。

1.2.8統計分析 采用SPSS19.0進行獨立t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-448在OGDR處理的SH-SY5Y細胞中的表達 OGDR組細胞存活率為(50.46±4.54)%，與正常培養組相比有統計學意義〔(100.00±2.00)%;t=17.3，P<0.000 1〕，說明模型構建成功。熒光定量PCR的結果顯示，miR-448的表達水平在OGDR組的SH-SY5Y細胞中顯著升高(8.49±0.97 vs 1.00±0.06;t=13.41，P=0.000 2)，表達水平為正常組的8.49倍。

2.2miR-448 inhibitor抑制miR-448表達驗證 與NC組相比，miR-448 inhibitor組SH-SY5Y細胞中miR-448的表達水平顯著降低(0.99±0.06 vs 0.17±0.07;t=15.66，P<0.000 1)。miR-448 inhibitor對SH-SY5Y細胞中miR-448表達的抑制率為83%，可以用于后續實驗。

2.3抑制miR-448表達對OGDR處理的SH-SY5Y細胞活力的影響 與Ⅰ組相比，Ⅱ組的細胞存活率顯著降低〔(100.00±4.00)% vs (50.13±5.63)%,P<0.05〕。Ⅲ組的細胞存活率顯著高于Ⅱ組〔(70.25±2.00)%,P<0.05〕。

2.4抑制miR-448表達對OGDR處理的SH-SY5Y細胞凋亡水平的影響 如圖1，與Ⅰ組相比，Ⅱ組的細胞凋亡率顯著升高〔(6.50±0.79)% vs (38.11±4.26)%,P<0.05〕，Ⅲ組細胞凋亡率顯著低于Ⅱ組〔(16.67±1.62)%,P<0.05〕。與Ⅰ組相比，Ⅱ組Bax表達水平明顯升高，Bcl-2的表達明顯降低。與Ⅱ組相比，Ⅲ組的細胞中Bax的表達水平明顯降低，Bcl-2的表達明顯升高。見表1、圖1、圖2。

表1 各組Bax、Bcl-2、SIRT1蛋白表達

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡水平

圖2 Western印跡檢測Bax和Bcl-2的表達

2.5miR-448靶基因SIRT1在OGDR處理的SH-SY5Y細胞中的表達 如圖3所示，與正常培養組(3.15±0.06)相比，miR-448靶基因SIRT1在OGDR組中的表達水平明顯降低(1.54±0.11，P<0.05)。

圖3 Western印跡檢測OGDR組SH-SY5Y細胞中miR-448靶基因SIRT1的表達水平結果

2.6抑制miR-448表達對OGDR處理的SH-SY5Y細胞中miR-448靶基因SIRT1表達的影響 如圖4所示，與Ⅰ組相比，Ⅱ組miR-448靶基因SIRT1的表達水平明顯降低。與Ⅱ組相比，Ⅲ組miR-448靶基因SIRT1的表達水平明顯升高。見表1、圖4。

圖4 Western印跡檢測抑制miR-448表達對OGDR處理的SH-SY5Y細胞中miR-448靶基因SIRT1表達的影響

3 討 論

作為內源性非編碼RNA的一種，miRNAs在腦血管疾病及神經系統疾病的發生發展中發揮重要的作用〔4，9〕。如let-7、miR-224-3p和miR-155在腦缺血再灌注引起的神經元細胞損傷中發揮重要的調控作用〔10～12〕。但miRNAs家族龐大，仍有眾多的miRNAs的功能尚未得到充分的闡明。本研究發現，miR-448在OGDR處理的SH-SY5Y細胞中明顯高表達。SH-SY5Y細胞是人神經母細胞瘤來源的細胞系，常被用來體外模擬神經細胞的缺血再灌注〔13，14〕。OGDR常被用來體外模擬腦缺血再灌注。因此，推測miR-448可能在腦缺血再灌注引起的神經元細胞損傷中發揮調控作用。

本研究發現降低miR-448的表達可以減少OGDR引起的SH-SY5Y細胞死亡，降低miR-448的表達可以抑制OGDR引起的SH-SY5Y細胞凋亡。本研究結果提示，miR-448可能促進腦缺血再灌注引起的神經元細胞損傷，抑制miR-448的表達可能成為治療腦缺血再灌注損傷的新方向。雖然目前沒有關于miR-448在腦缺血再灌注損傷中發揮調控作用的報道，但其在脊髓缺血/再灌注損傷中的作用〔8〕可支持本研究的結論。Wang等〔8〕發現，miR-448在缺血再灌注損傷模型大鼠的脊髓組織和缺氧誘導的神經細胞中高表達，且下調miR-448可抑制神經細胞凋亡，改善缺血再灌注損傷模型大鼠的神經功能。另外，有研究發現，急性腦缺血小鼠恢復供血后3 h，血液中miR-448的表達量就達到峰值〔7〕。因此，這些結果支持本研究的結論，即miR-448可能在腦缺血再灌注過程中發揮重要的調控作用，抑制miR-448的表達可能成為治療腦缺血再灌注損傷的新方向。

miRNAs通過與mRNA的3′非編碼區(3′-UTR)結合靶向調控靶mRNA的翻譯或者參與靶mRNA的降解，進而參與多種疾病及生理過程的調節〔2，4，9，15〕。因此，鑒定miRNAs的靶基因對闡明miRNAs的調控機制至關重要。Wang等〔8〕研究發現，miR-448通過靶向 SIRT1參與調控脊髓缺血/再灌注引起的損傷。SIRT1是高度保守的去乙酰化酶家族成員，對多種因素引起的神經元損傷發揮保護作用。如SIRT1參與保護剪切力誘導的神經元損傷、缺氧誘導的神經損傷和缺血再灌注誘導神經損傷〔8，16～18〕。基于SIRT1在神經損傷保護中的重要作用，推測miR-448可能通過靶向SIRT1調節腦缺血再灌注引起的神經元細胞損傷。本研究結果說明，miR-448可以在OGDR處理的SH-SY5Y細胞中靶向調控SIRT1，miR-448可能通過靶向調控SIRT1參與腦缺血再灌注引起的神經元細胞損傷過程。但這尚屬于推論，仍需進一步的體內實驗加以證明。另外，miR-448潛在的及已經證明的靶基因有多個，miR-448是否通過其他靶基因參與腦缺血再灌注引起的神經元細胞損傷過程？仍需進一步的實驗加以證明。

綜上所述，OGDR處理引起miR-448在SH-SY5Y細胞中高表達，降低miR-448的表達可以抑制OGDR引起的SH-SY5Y細胞凋亡和死亡，說明降低miR-448的表達可以減輕OGDR引起的SH-SY5Y細胞損傷。鑒于OGDR處理人神經母細胞瘤模型常用來模擬神經細胞的缺血再灌注，因此，推測miR-448可能在腦缺血再灌注過程中發揮重要的調控作用，抑制miR-448的表達可能成為治療腦缺血再灌注損傷的新方向。