泛耐藥鮑氏不動桿菌氨基糖苷類耐藥相關基因研究

鮑群麗 柯俊 胡芳 張利紅 黃艷 程攀 彭紫檀 汪宏良

摘 ? 要：目的 ?探討泛耐藥鮑氏不動桿菌氨基糖苷類抗菌藥物耐藥機制。方法 ?收集2014年湖北省黃石市中心醫院住院患者中分離的20株泛耐藥鮑氏不動桿菌，用mdfA測序確認菌種，再采用聚合酶鏈反應法分析16種氨基糖苷類藥物獲得性耐藥相關基因。 結果 ?20株泛耐藥鮑氏不動桿菌共檢出4種氨基糖苷類獲得性耐藥基因，氨基糖苷類修飾酶基因aac（3）-Ⅰ陽性率15.00%;ant（3"）-Ⅰ陽性率20.00%;aph3'-Ⅰ陽性率100.00%;16SrRNA甲基化酶未檢出;外排泵adeB基因陽性率95.00%。 結論 泛耐藥鮑氏不動桿菌中攜帶的耐藥基因和耐藥表型相對應，對氨基糖苷類藥物耐藥與產aac（3）-Ⅰ、ant（3"）-Ⅰ、aph3'-Ⅰ修飾酶基因和獲得外排泵adeB 2種耐藥機制有關。

關鍵詞：鮑氏不動桿菌;氨基糖苷類修飾酶基因;外排泵基因;泛耐藥

中圖分類號：R378 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.05.025

文章編號：1006-1959（2018）05-0078-03

Study on Aminoglycoside Pan Resistance Related Genes of Acinetobacter Baumannii

BAO Qun-li，KE Jun，HU Fang，ZHANG Li-Hong，HUANG Yan，CHENG Pan，PEN Zi-Tan，WANG Hong-Liang

（Department of Clinical Laboratory，Huangshi Central Hospital，Huangshi 435000，Hubei，China）

Abstract：Objective ?To investigate the mechanism of aminoglycoside Pan resistance of Acinetobacter baumannii.Methods ?20 strains of Pan resistance Acinetobacter baumannii isolated from hospitalized patients in Huangshi central hospital of Hubei province in 2014 were identified by mdfA sequencing.Polymerase chain reaction was used to analyze the acquired resistance related genes of 16 aminoglycosides.Results ?A total of 4 aminoglycoside-resistant Acinetobacter baumannii strains were detected in 20 Pan-resistant Acinetobacter baumannii strains.The aminoglycoside modifying enzyme gene aac（3）-I was positive in 15.00%;ant（3"）-I The positive rate was 20.00%;aph3'-I，the positive rate was 100.00%;16S rRNA methylase was not detected;the positive rate of adeB gene of the efflux pump was 95.00%.Conclusion ?The drug-resistance genes in pan-resistant Acinetobacter baumannii correspond to drug resistance phenotypes，and they are resistant to aminoglycosides and produce aac（3）-I，ant（3"）-I，aph3'-I the modification of the enzyme gene and the acquisition of efflux pump adeB are related to two drug resistance mechanisms.

Key words：Acinetobacter baumannii;Aminoglycoside modifying enzyme gene;Efflux pump gene;Pan-resistance

繼臨床分離到多藥耐藥的鮑氏不動桿菌（MDRAB）后，更嚴重的泛耐藥鮑氏不動桿菌（XDRAB）與極度耐藥鮑氏不動桿菌（PDRAB）在國內外都有分離報告[1-3]。為全面了解XDRAB氨基糖苷類抗菌藥物耐藥機制，我們對分離自湖北省黃石市中心醫院20株XDRAB進行了9種氨基糖苷類修飾酶基因、6種16SrRNA甲基化酶基因以及外排泵adeB基因檢測，現報道如下。

1資料與方法

1.1 細菌來源 ?20株XDRAB均分離自2014年1月～12月黃石市中心醫院住院患者各種標本鑒定的菌株，每位患者一株菌。

1.2 菌種鑒定和藥敏試驗 ?全部XDRAB經鮑氏不動桿菌種特異基因mdfA檢測確認。藥敏試驗采用K-B紙片瓊脂擴散法測定菌株對抗菌藥物的抑菌環直徑。藥敏紙片為英國Oxoid公司產品，培養基為法國生物梅里埃公司產品，結果判斷按美國臨床實驗室標準協會（CLSI）2013版執行。

1.3細菌DNA制備 ?蛋白酶K水解離心快速裂解法。

1.4基因檢測 ?耐藥元件檢測均為聚合酶鏈反應（PCR）法（全部PCR引物和商品化PCR盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供）。20株XDRAB耐藥元件檢測項目：9種氨基糖苷類修飾酶基因aac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（6'）-Ⅰad、aac（6'）-Ⅰb、aac（6'）-Ⅱ、ant（2"）-Ⅰ、ant（3"）-Ⅰ、ant（4'）-Ⅰ、aph3'-Ⅰ;6種16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA;1種獲得性外排泵泵蛋白基因adeB，靶基因引物識別序列和目的產物長度，見表1。

2結果

2.1 XDRAB藥敏試驗 ?20株XDRAB對17種抗菌藥物：哌拉西林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、美洛培南、阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星、左旋氧氟沙星、復方新諾明、氯霉素、米諾環素、四環素、多粘菌素。耐藥率：除了對多粘菌素全部敏感外，對其他抗菌藥物耐藥率均在80.00%以上。

2.2泛耐藥鮑氏不動桿菌標本臨床來源分布情況及患者基本情況 ?20株泛耐藥鮑氏不動桿菌中，12株來源于重癥監護病房，8株來源于神經外科病房，多為氣管插管、導尿管的使用、導管留置時間延遲等各種侵入性操作的患者。

2.3 基因檢測結果 ?20株泛耐藥鮑氏不動桿菌共檢出4種氨基糖苷類獲得性耐藥基因，氨基糖苷類修飾酶基因aac（3）-Ⅰ陽性率15.0%;ant（3"）-Ⅰ陽性率20.0%;aph3'-Ⅰ陽性率100.00%;16SrRNA甲基化酶未檢出;外排泵adeB基因陽性率95.0%，見表2。

2.4 ?陽性耐藥基因PCR電泳圖 ?陽性耐藥基因（aac（3）-Ⅰ、ant（3"）-Ⅰ、aph3'-Ⅰ、adeB）PCR電泳圖，見圖1。

3討論

臨床致病菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥機制主要為[4-8]：①氨基糖苷類修飾酶基因的產生;②外膜蛋白的通透性改變以及藥物外排泵的激活和過度表達;③核糖體結合位點的改變，其中最常見的原因是耐藥機制一。

鮑曼不動桿菌是醫院內感染的重要病原菌之一，從我們的實驗中可以看出，20株鮑曼不動桿菌中，3株aac（3）-Ⅰ基因陽性，4株ant（3"）-Ⅰ基因陽性，20株aph3'-Ⅰ基因陽性，提示我院多重耐藥鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥與攜帶耐藥相關基因有關。

近年來，國外和我國臺灣地區報道了在臨床分離菌中發現了一類新耐氨基糖苷類抗菌藥物的酶16S rRNA 甲基化酶，由質粒介導，能使該類抗菌藥物的作用靶位甲基化，使藥物無法結合到細菌16SrRNA，導致所有該類抗菌藥物高水平耐藥[9，10]。由16S rRNA甲基化酶基因介導的高水平氨基糖苷類抗菌藥物耐藥引起學者越來越多的關注， 到目前為止， 已發現6種16SrRNA 甲基化酶（armA 、rmtA、rmtB、rm tC 、rmtD、npmA），本實驗雖然未檢出16SrRNA 甲基化酶基因，但依然要加強抗菌藥物合理使用和醫院感染控制， 避免16SrRNA甲基化酶基因的播散。

本次研究發現，耐藥不動桿菌屬中，外排泵基因數量高于不耐藥不動桿菌屬[11-13]，提示外排泵基因在細菌耐藥表型中也起作用。本研究檢測了adeB外排泵基因，adeB基因編碼內膜外排泵，是鮑氏不動桿菌外排泵Ade ABC中重要的組成系統，本組19株adeB基因陽性，提示本院多重耐藥鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥與攜帶ade B外排泵基因有關。

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