2種木霉菌肥對馬尾松幼苗生長及抗立枯病的影響*

蔣仙，祝靜，于存

(貴州大學 林學院，貴州 貴陽 550025)

木霉菌(Trichodermaspp.)在抵御病原菌對植物的侵害過程中發揮了重要的作用，是目前應用最廣泛的控制土傳病害的生防真菌。木霉菌可以通過直接拮抗植物土傳病原菌、改善植物營養狀況、誘導抗病物質積累和防御酶體系建立等途徑提高植物對土傳病害的抗病性[1]。木霉防治病害的主要機制包括：通過代謝產物抑制病原菌生長，激發植物免疫系統[2]，以及通過營養競爭、菌絲纏繞、分泌抑菌的代謝產物等多種機制進行病害的防治[3]。袁玉娟等[4]研究發現木霉通過產生木霉素、膠霉素、綠木霉素、抗菌肽等抑制植物病原菌生長。涂晶晶等[5]研究發現擬康寧木霉(Trichodermakoningiopsis)Hailin菌株對尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)產生明顯抑制，并且可以有效地提高馬尾松(Pinusmassoniana)對立枯病的抗性。另外，木霉在對多種植物病害發揮防治作用的同時，還可以促進植物的生長。如張樹武等[6]研究發現深綠木霉(T.atroviride)可以通過改善植株的葉綠素含量、可溶性蛋白質含量等生理指標的方式來促進白三葉草(Trifoliumrepens)的生長。然而，木霉菌在田間應用時易受環境條件影響使其防病和促生效果不穩定[7]。因此，將木霉菌制作成固態菌肥可以有效提高其在土壤中的定殖率，還可以極大地改善木霉活體儲存期短、使用不方便等缺點。木霉菌肥是一種微生物活體制品，可以通過自身生命活動的方式來促進植物對營養元素的吸收，使得植物獲得特定的肥料效應[8]。木霉菌肥施用后可在土壤內快速繁殖，短時間即可形成優勢群體，優勢群體可以提高土壤酶活性，使不溶性土壤養分溶解，促進植物對養分的吸收，提高土壤中養分的循環轉化，促進形成良好的根際環境[9]。以往已有較多利用木霉菌肥促進植物生長的例子，不同植物開發特定功能的木霉菌肥配方對不同植物的促生和防病具有重要的意義[10]。

馬尾松是松科(Pinaceae)松屬(Pinus)的常綠喬木，是我國南方重要的山地造林先鋒樹種[11]。因馬尾松苗期栽植密度大、短期集約式育苗導致的土壤肥力下降已成為遏制馬尾松育苗產業健康發展的重要限制因子[12]。此外，馬尾松在幼苗期病害頻發，使得馬尾松在育苗造林和資源利用上受到了嚴重制約，而立枯病被認為是馬尾松苗期最嚴重的病害之一，嚴重時可致80%幼苗的死亡[13]。目前，利用生物菌肥代替傳統的化學肥料和農藥進行林木促生和病害防治是現代林業的發展方向之一。以往主要通過利用外生菌根菌來對馬尾松的生長進行研究，但外生菌根菌對馬尾松的作用受溫度、pH環境條件和菌根菌在根部的有效侵染等因素的限制[14]。而木霉可以定殖于土壤和植物體內，進而發揮促生和病害防治的功能，針對馬尾松開發高效的木霉菌肥，對馬尾松的促生和病害的生物防治具有重要的現實意義。

本研究分別以長枝木霉(T.longibrachiatum)菌肥和擬康寧木霉菌肥處理馬尾松幼苗，研究2種木霉菌肥對馬尾松苗生長、生理和馬尾松苗立枯病的抗性，進而為木霉菌肥在馬尾松促生及立枯病防控上的應用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株為長枝木霉、擬康寧木霉和尖孢鐮孢菌，由貴州大學林學院提供，采用PDA斜面保存于貴州大學森林保護實驗室4 ℃冰箱中；供試土壤采自貴陽市花溪區貴州大學馬尾松人工林；供試馬尾松種子由貴州省都勻市馬鞍山林場馬尾松國家林木良種基地提供；供試珍珠巖和蛭石由貴州格瑞恩生物技術有限公司提供；供試菌肥是由木霉菌液(106cfu/mL)按每克基質接入0.3 mL的菌液比例添加到混有菜籽油餅和麥麩[菜籽油餅(m)︰麥麩(m)=3︰7]的固體基質中，每克基質添加2 mL MendeLs營養液和2.5 mL蒸餾水，用0.5 mol/L的NaOH和0.5 mol/L的HCl調整基質的pH值為6.0，于28 ℃恒溫箱中培養7 d后獲得孢子濃度為1011cfu/g的木霉菌肥。MendeLs營養液的組成為：(NH4)2SO44 g/L、MgSO40.3 g/L、KH2PO42g/L、CaCl2·2 H2O 0.3 g/L、FeSO4·7 H2O 5 mg/L、MnSO41.6 mg/L、ZnSO41.4 mg/L、CoCl22 mg/L，蒸餾水定容至1 L；菜籽油餅和麥麩購自貴陽花溪區農貿市場；木霉和尖孢鐮孢菌的培養采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)和馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

采用室內盆栽試驗，將菌肥與基質土(馬尾松林土︰蛭石︰珍珠巖=6︰3︰1)混勻后移栽5個月生馬尾松幼苗，每1 000 g滅菌基質土中加入10 g的木霉菌肥，使得每克基質土中木霉孢子濃度為109cfu/g。采用傷根浸泡法和灌根法將尖孢鐮孢菌菌液(孢子濃度為106cfu/ml)接種至馬尾松苗根部[15]。設置6個處理，分別為：菌肥基質(CK)、長枝木霉菌肥(P1)、擬康寧木霉菌肥(P2)、菌肥基質+尖孢鐮孢菌(Fo)、P1+Fo和P2+Fo。每個處理30盆，每盆移栽4株幼苗。于2020年5月在貴州大學西校區林學院溫室內進行。將盆栽幼苗置于溫室內培育，統一管理培育60 d后，對馬尾松幼苗的生長指標、根際土壤養分、病害發生率及抗病生理指標進行測定。

1.2.2 指標測定

(1)馬尾松苗生長及生物量測定 不同處理馬尾松苗60 d后，每個處理隨機選取10株幼苗，使用卷尺測量并記錄苗高。自地徑處將新鮮馬尾松幼苗剪斷，將幼苗分為地上和地下兩部分。以上樣品用流水反復沖洗直至洗凈，使用濾紙吸干表面多余水分后，測量主根長并統計側根數，同時對洗凈的地上和地下部分的樣品進行生物量的測定，葉片和根系的鮮重利用十萬分之一的電子天平稱量，然后放入80 ℃烘箱烘至恒重后，再稱量葉片和根系干重。

(2)馬尾松苗生理指標測定 取處理60 d后的馬尾松苗，利用丙酮提取法測定葉綠素含量[16]。將取完根際土的苗經自來水沖洗干凈附著土壤后，用無菌水清洗3次，用無菌濾紙吸干水分，每個處理隨機選取3株幼苗，利用TTC法測定根系活力[17]。以上處理均重復3次。

(3)土壤養分測定 取不同處理60 d后馬尾松苗，每個處理隨機選擇10株苗，用無菌毛刷將馬尾松根系附近(<4 mm)范圍內的土壤刷下后，保存于無菌三角瓶中用于根際土壤養分的測定。土壤養分測定采用鮑士旦的方法[18]。其中，土壤全氮測定采用凱氏定氮法，土壤水解氮測定采用堿解-擴散吸收法，土壤全磷測定采用堿熔-鉬銻抗比色法，土壤有效磷測定采用鉬銻抗比色法，土壤全鉀測定采用消煮液-火焰光度法，土壤速效鉀測定采用乙酸銨浸提-火焰光度法。以上每個處理均重復3次。

(4)立枯病發病情況調查及抗病指標測定 采用傷根浸泡法和灌根法對健康的馬尾松幼苗進行室內防治試驗[15]。病原菌處理馬尾松苗60 d后統計馬尾松苗立枯病的發病率和發病等級，并計算病情指數和相對防治效果。發病率、發病等級、病情指數和相對防治效果的計算參考Luo X和Yu C[13]的方法。取不同處理馬尾松苗，用無菌水洗凈后，用無菌濾紙吸干水分，分別收集葉片和根系，并迅速用液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱用于生理指標的測定。POD、SOD及CAT指標測定采用索萊寶生產的BC0090型號試劑盒進行測定。相對電導率的測定采用電導儀法測定[19]。每個處理取120株苗用于幼苗病害發生率、發病等級、病情指數和相對防治效果的統計，以上處理均重復3次。

1.3 統計及分析

運用Microsoft Excel 2019對得到的原始試驗數據進行整理，運用IBM SPSS 24統計軟件進行方差分析和多重比較。參數均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比較采用Duncan法進行比較(α=0.05)。表中數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 2種木霉菌肥對馬尾松幼苗生長及生物量的影響

2種木霉菌肥對馬尾松幼苗生長及生物量指標的影響結果見表1。由表1可知，與CK相比，施用P1、P2幼苗的苗高分別高出17.52%和13.93%；施用P1、P2的幼苗根長分別長出82.14%和97.99%；施用P1的幼苗側根數最多，比CK處理多出81.86%；同時，施用P1的幼苗葉片和根系的鮮重比CK處理分別增加97.06%和60.00%；施用P1的幼苗葉片和根系的干重比CK處理分別增加50.00%和100.00%；施用P2的幼苗葉片和根系鮮重比CK處理分別增加61.76%和20.00%；施用P2的幼苗葉片和根系干重比CK處理分別增加40.00%和50.00%。施用P1、P2的苗高、根長及干鮮重均與CK存在顯著差異(P<0.05)。由圖1也可看出2種木霉菌肥對馬尾松苗生長的促進作用。

表1 2種木霉菌肥處理下馬尾松幼苗的生長及生物量指標

圖1 2種木霉菌肥處理下馬尾松苗生長圖

2.2 2種木霉菌肥對馬尾松苗生理的影響

2種木霉菌肥對馬尾松苗根系活力、葉綠素的影響見圖2。由圖2A可知，施用P1和P2的幼苗根系活力顯著提高，與CK相比，施用P1、P2的幼苗根系活力分別提高45.69%和35.44%；施用P1、P2的幼苗根系活力與CK均存在顯著差異(P<0.05)。

由圖2B可知，施用木霉菌肥的幼苗葉綠素較CK組有顯著的提高，其中施用P1的幼苗葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素分別比CK處理增加90.41%、34.34%和45.90%；施用P2的幼苗葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素分別比CK處理增加93.10%、37.01%和48.39%；同時，施用P1、P2的幼苗葉綠素與CK均存在顯著差異(P<0.05)。

圖2 2種木霉菌肥處理下馬尾松幼苗生理指標

2.3 2種木霉菌肥對馬尾松苗根際土壤養分的影響

施用2種木霉菌肥后馬尾松苗根際土壤養分的測定結果見表2。由表2可知，施用P1、P2的幼苗土壤全氮、全磷、全鉀、水解氮、速效磷和速效鉀與CK均存在差異。與CK相比，施用P1幼苗根際土的全氮、全磷、全鉀、水解氮、速效磷和速效鉀分別提高61.43%、50.68%、47.95%、30.89%、57.92%和29.17%；施用P2的幼苗根際土全氮、全磷、全鉀、水解氮、有效磷和速效鉀分別提高69.39%、60.27%、54.49%、32.52%、80.79%和18.01%。

表2 2種木霉菌肥處理下馬尾松幼苗土壤養分含量

2.4 2種木霉菌肥對馬尾松幼苗立枯病的防治效果

2種木霉菌肥對馬尾松幼苗立枯病的防治效果見圖3。由圖3可知，與Fo處理相比，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗發病率分別降低49.09%和54.48%；P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗病情指數分別降低43.75%和58.33%；P1+Fo、P2+Fo處理對幼苗立枯病的相對防治效果分別為49.09%和54.48%。

圖3 2種木霉菌肥處理下馬尾松幼苗抗立枯病的防治效果圖

2.5 2種木霉菌肥對馬尾松幼苗抗病生理指標的影響

2種木霉菌肥對馬尾松苗保護性酶活性和相對電導率的影響的結果見圖4。由圖4A可知，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗葉片和根系的SOD活性與Fo均存在顯著差異。與Fo相比，P1+Fo處理的幼苗葉片和根系中SOD活性含量分別提高66.67%和61.04%；P2+Fo處理的幼苗葉片和根系中SOD活性含量分別提高43.06%和42.86%。

圖4 2種木霉菌肥處理下馬尾松幼苗抗立枯病生理指標

由圖4B可知，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗葉片和根系的POD活性與Fo均存在顯著差異。與Fo相比，P1+Fo處理的幼苗葉片和根系中POD活性含量分別提高113.02%和52.40%；P2+Fo處理的幼苗葉片和根系中POD活性含量分別提高98.07%和43.24%。

由圖4C可知，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗葉片和根系的CAT活性與Fo均存在顯著差異。與Fo相比，P1+Fo處理的幼苗葉片和根系中CAT活性含量分別提高50.00%和41.73%；P2+Fo處理的幼苗葉片和根系中CAT活性含量分別提高41.94%和35.97%。

由圖4D可知，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗相對電導率與Fo均存在顯著差異。施用P1處理的幼苗相對電導率最低，其中，與Fo相比，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗相對電導率分別降低34.21%和26.32%。

3 討論與結論

將功能微生物制作為菌肥可有效提高菌株在植物中的作用效果，進而更好的發揮促生和防治病害的功能[20-21]。木霉對植物的促生作用主要體現在植物根系的各項形態學指標、植株的總根長、根尖數以及株高等方面[22]。本研究中，長枝木霉菌肥和擬康寧木霉菌肥均可不同程度地促進馬尾松幼苗的高度和生物量，同時2種木霉菌肥還可以促進馬尾松根系的長度、分枝和根系活力，表明2種木霉菌肥均具有培育壯苗的效果。這與擬康寧木霉Hailin菌株可以促進馬尾松生長的研究結果相近，但本研究中2種木霉菌肥對馬尾松的促生效果顯著高于擬康寧木霉Hailin菌株對馬尾松苗的促進作用[5]。分析這個差異的原因可能是將木霉制作為菌肥發揮了比木霉菌液更明顯的促生作用[20]。以往報道顯示，木霉在促進植物生長的同時還可以影響植物的生理生化[23]。本研究中，2種木霉菌肥可以提高馬尾松苗的根系活力和葉綠素的含量，同時還可提升苗的保護性酶活性，由此判斷2種木霉菌肥對馬尾松生長和抗病相關生理都起到了積極的作用，通過本研究可以為未來木霉菌肥在馬尾松促生上的施用提供借鑒。這與綠木霉處理可以提升樟子松(Pinussylvetrisvar.mongolica)苗抗氧化酶系統活性的結論相似[24]。本試驗還處于盆栽實驗階段，對于野外大田的應用效果目前還不清楚，還需進一步進行野外應用研究。

氮、磷、鉀元素是植物生長過程中必需的營養元素，其含量的高低是直觀反應植物吸收土壤養分的重要指標[25]。以往已有多個利用微生物提高植物根際土壤養分含量的報道[26]，其主要作用機理是調節微生物的固氮、溶磷、解鉀和分泌生長激素等能力[27]。本研究中，2種木霉菌肥可以顯著改善馬尾松苗根際土壤養分含量。其中，根際土全氮、全磷和全鉀的增加可能與木霉菌肥基質加入后，被木霉作用而釋放出了更多的氮、磷和鉀有關。根際土有效磷、速效鉀和水解氮的增加可能與木霉菌具有溶磷能力、固氮能力和降低土壤pH進而活化土壤中的養分有關[28-29]。

通過在植物根部施入生防菌株可以有效地防治土傳病害[30]。本研究中，2種木霉菌肥在對馬尾松立枯病的防治效果為49.1%和54.5%，要低于劉福平等[31]利用綠粘帚霉對馬尾松苗的防治效果61.2%。分析病害防治效果的差異，可能與不同菌株對病原菌的抑制機理不同，進而使其抑菌能力存在差異，也可能和試驗所處的外部環境條件如溫度、濕度、土壤類型、苗木的大小等有關。以往關于2種木霉對病原菌的直接抑菌機制的報道已經很多[32]。前期研究中發現擬康寧木霉可以通過菌絲纏繞、產生代謝產物與幾丁質酶等方式抑制病原菌的生長[5,33]。本研究中發現，2種木霉菌肥均可提高馬尾松苗保護性酶的活性，同時，2種木霉菌肥可降低馬尾松苗相對電導率，進而減少病原菌對苗木的傷害。結合本研究2種木霉菌肥對馬尾松苗的促生作用，可推斷2種木霉菌肥可以通過抑制病原菌生長、促進植物生長和提高馬尾松自身的免疫能力進而降低尖孢鐮孢菌對馬尾松苗木的傷害。這與祁金玉等[34]報道的木霉可以通過對病原菌的直接抑制作用、誘導植物系統抗性等直接和間接的作用發揮樟子松對立枯病的抗病功能的結論相近。

綜上所述，2種木霉菌肥對馬尾松苗的生長、生理和養分吸收均表現出積極的作用；同時，添加2種木霉菌肥還能增強馬尾松對立枯病的抗性。但是生物菌肥的施用方式、施用量、施肥時間與肥效的持效期關系還需要進一步研究，以期使生物菌肥能被大范圍、大幅度地推廣使用。