熒光定量PCR方法在結核分枝桿菌復合群檢驗中的應用價值

王純?nèi)A 郭秋霞 謝漢彬

廣東省汕頭市第三人民醫(yī)院檢驗科，廣東汕頭 515000

結核病是危害我國公共衛(wèi)生健康安全的重要疾病之一，盡早診斷結核病對于預防該病的傳播具有重要意義[1]。目前臨床診斷結核病的方法仍舊是采取實驗室培養(yǎng)的方式，但是這種方式的耗時長，檢驗效率低下，無法進行大數(shù)據(jù)篩查[2]。熒光定量PCR方法是一種高效且靈敏度、特異度較高的檢驗方法，能夠有效鑒別結核分枝桿菌復合群的實際狀態(tài)，從而指導臨床診斷與治療，做出更加科學的決策[3]。為了進一步分析熒光定量PCR方法的應用價值，本研究選取2019年6月至2020年6月醫(yī)院接收436例結核可疑患者共計470份臨床樣本進行對照觀察，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月至2020年6月醫(yī)院接收436例結核可疑患者，其中男225例，女211例；年齡19～68歲，平均（41.0±8.6）歲，共計470份臨床樣本（其中414份為肺內(nèi)樣本，56份為肺外樣本），本研究樣本中肺內(nèi)樣本主要為痰液樣本，肺外樣本包括了胸腔積液、淋巴結液、尿液、膿液等樣本。入選患者均對本研究知情并簽署同意。

1.2 方法

1.2.1 實驗室培養(yǎng) 將痰，胸腔積液、淋巴結液、尿液、膿液等樣本進行前處理后放入改良羅氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 熒光定量PCR法檢測方法 將痰液化后和胸腔積液、淋巴結液、尿液、膿液等樣本離心，取沉淀進行滅活，結束后至室溫離心然后將樣本加入結核桿菌復合群核酸檢測試劑增強液到Lab Aid 824提取儀提取核酸。將待測樣本及陰陽對照品加入TB-DNA提取液分裝至8聯(lián)管孔上SLAN-96SPCR擴增。儀器PCR反應程序：先使用50℃ UNG處理，持續(xù)時間為2 min，之后使用95℃ UNG酶失活，預變性10 min，之后Touchdown循環(huán)程序10個，PCR循環(huán)程序45個，之后根據(jù)標準曲線計算CT值。本研究采用SLAN-96S核酸擴增儀、BD BACTEC MGMT960結核分枝桿菌培養(yǎng)儀、培養(yǎng)管批號：國械準進20142405711，結核分枝桿菌復合群核酸檢驗劑批號為：20112601。

1.3 觀察指標及評價標準

以實驗室培養(yǎng)為金標準，分析熒光定量PCR法的檢驗結果，并觀察熒光定量PCR方法檢測結核分枝桿菌復合群的靈敏度與特異度。靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%。特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 熒光定量PCR法肺內(nèi)樣本檢測結果

在414份肺內(nèi)樣本中，培養(yǎng)陽性共計60份，培養(yǎng)陰性共計354份，熒光定量PCR檢測中靈敏度為97.8%，特異度為97.5%，見表1。

表1 熒光定量PCR法肺內(nèi)樣本檢測結果

2.2 熒光定量PCR法肺外樣本檢測結果

在56份肺外樣本中，培養(yǎng)陽性共計12份，培養(yǎng)陰性共計44份，熒光定量PCR檢測中靈敏度為100.0%，特異度為94.4%，見表2。

表2 熒光定量PCR法肺外樣本檢測結果

2.3 熒光定量PCR法總樣本檢測結果

本研究結果顯示，熒光定量PCR檢測中靈敏度為98.2%，特異度為97.2%，見表3。

表3 熒光定量PCR法總樣本檢測結果

3 討論

結核病是一種傳染性疾病，自抗結核病治療方案應用以來，耐藥以及耐多藥結核病的發(fā)生率不斷升高，同時存在HIV以及結核分枝桿菌雙重感染的風險，加上全球人口流動性的提高使得結核病的發(fā)生率有所升高，即使是歐美國家也有出現(xiàn)反彈的情況[4]。根據(jù)世界衛(wèi)生報告組織調(diào)查顯示，世界有超過1/3的人感染了結核桿菌，也就是有超過20億人感染結核桿菌，而活動性肺結核患者數(shù)量超過2000萬，每年新增結核病患者超過300萬，我國是結核病高發(fā)國家之一，活動性肺結核患者數(shù)量位居全球第二，根據(jù)我國流行病調(diào)查結果顯示，我國活動性肺結核患者超過600萬，且傳染性肺結核患者超過200萬[5]。因此防治結核病是我國臨床醫(yī)學研究的重要課題。

結核分枝桿菌在干痰中存活6～8個月，如粘附在塵埃上傳染性可保持8～10 d，在酸性溶液中能夠存活30 min，但是對紫外線以及酒精的抵抗力弱，太陽直射2～3 h失活，75%乙醇接觸后數(shù)分鐘內(nèi)死亡[6]。近年來隨著該病發(fā)生率的升高，發(fā)現(xiàn)耐藥性與耐多藥結核分枝桿菌不斷增多，甚至出現(xiàn)流行的趨勢[7]。耐藥結核桿菌感染使得臨床治療越來越復雜，尤其是對異煙肼、利福平耐藥的患者。

結核桿菌感染可分為原發(fā)性感染與繼發(fā)性感染[8]。原發(fā)性結核桿菌感染常見于兒童、老年人以及免疫力低下人群，主要是由于結核桿菌隨著飛沫以及灰塵進入肺泡，而巨噬細胞吞噬結核桿菌之后由于吞噬體與細胞壁上的碳酸腦苷脂結合從而無法起到殺菌的作用，使得結核桿菌大量生長，引起炎癥病灶[9]。隨著機體免疫反應的作用，原發(fā)病灶能夠自愈，但是其中潛伏著一些結核桿菌，在不斷免疫反應的刺激下形成抗結核免疫力，也可以作為條件感染的病因[10]。少量免疫力極低患者可能經(jīng)淋巴、血流引起全身結核或結核性腦膜炎[11]。繼發(fā)性感染常見于成年人，主要特征為病灶局限并形成慢性肉芽腫性炎癥，形成結核結節(jié)，出現(xiàn)干酪樣壞死[12]。結核桿菌雖然具有較高的感染率，但是發(fā)病率相對較低，由此可見人體感染結核桿菌之后能夠形成一定的免疫力，且主要體現(xiàn)在細胞免疫上。

目前臨床診斷結核病主要是采取實驗室培養(yǎng)為金標準，但是其檢驗時間長，容易錯過疾病治療的最佳時間，并且可能造成該病的傳播。因此為了盡可能提高結核病的臨床診斷結果，需要采取更加有效的檢驗方法[13]。熒光定量PCR方法是臨床檢驗的常用方法，主要采取決定定量和相對定量，前者主要是利用已知標準曲線來計算樣本量，而后者則主要是利用靶序列相對于另一組參照序列的變化信息計量[14]。熒光定量PCR方法目前在臨床醫(yī)學中有著廣泛的應用，其在HIV、結核桿菌、巨細胞病毒、EB病毒等病原體檢測中具有較好的應用價值[15]。

熒光定量PCR方法不僅能夠對病原體進行定性定量分析，同時由于差異小、重復性好的優(yōu)勢，能夠定量病原體DNA、RNA，最主要的是能夠對病原體復制與活動情況進行動態(tài)觀察，從而為疾病檢查確定觀察，例如抗病毒治療效果、藥敏測試等。熒光定量PCR方法在臨床應用過程中發(fā)現(xiàn)與結核桿菌核算量與該病的發(fā)生、發(fā)展以及預后之間有密切的相關性，且樣本中細胞因子含量低的情況下也有著較高的敏感性與準確性，因此對于該病的臨床診斷與治療評估有著較好的應用價值。本研究中414份肺內(nèi)樣本中，培養(yǎng)陽性共計60份，培養(yǎng)陰性共計354份，熒光定量PCR檢測中靈敏度為97.8%，特異度為97.5%；在56份肺外樣本中，培養(yǎng)陽性共計12份，培養(yǎng)陰性共計44份，熒光定量PCR檢測中靈敏度為100.0%，特異度為94.4%。以本研究總樣本的培養(yǎng)結果來看，熒光定量PCR檢測中靈敏度為98.2%，特異度為97.2%，由此可見熒光定量PCR方法具有較好的應用效果，能夠有效提高結核病的臨床診斷準確率，有助于患者盡早進行治療，從而改善患者的預后情況。

綜上所述，熒光定量PCR方法在結核分枝桿菌復合群臨床檢驗中具有較高的靈敏度與特異度，值得推廣應用。