徐州地區土壤中放線菌的分離鑒定

◇江蘇省徐州醫藥高等職業學校 郭慶宇 朱中原 陳 曦

采集徐州范圍不同類型土壤，從中分離培養放線菌。統計各類型土壤樣本中放線菌含量及種類，發現鏈霉菌占大多數，還有部分小單孢菌類。農作物地和植物地及城市荒地中放線菌含量豐富，在沙地等貧瘠土地中含量較少。挑出有特點的菌落進行單菌種培養，得到一株稀有放線菌，用埋片法觀察該株放線菌形態特征，并做電鏡掃描，初步鑒定為小雙孢菌。將此菌株接種在不同常規培養基上，發現在各種培養基上均能生長，但未產生可溶性色素。

放線菌種類繁多，代謝功能各異，是非常有實用價值的一類菌，受到極大重視[1]。當前發現的放線菌只占自然界的10%～20%，所以改進分離方法、尋找新的放線菌，是放線菌資源調查開發的一個重要方面[2]。土壤是放線菌習居的良好場所，土壤理化性質和土壤形成的環境條件強烈影響并決定著土壤放線菌的種類、數量及生理生化性質[3]。

1 研究內容

從徐州地區采集不同類型的土壤樣本，選擇性培養放線菌，從中篩選長勢良好的放線菌，并進行定向富集培養，鑒定菌種，總結不同土壤中放線菌含量與種類的規律。

2 實驗設計

2.1 實驗儀器

HZQ-C 空氣浴振蕩器，電子天平，無菌工作臺，1 mL、10 mL移液管，40 μL、100 μL微量注射器，全自動壓力蒸汽滅菌鍋，100目篩。

2.2 實驗試劑

硫酸鎂，硫酸亞鐵，硝酸鉀，磷酸氫二鉀，氯化鉀，硫酸銨，碳酸鈣，重鉻酸鉀，瓊脂，可溶性淀粉，蔗糖，葡萄糖，牛肉汁，酵母浸膏。

2.3 實驗設計

（1）土樣采集。選擇江蘇徐州范圍內不同類型土壤，挖出地表土以下約5厘米土壤，裝入潔凈信封，共采集12處土樣。

（2）土樣處理。①風干粉碎。將采集好的土樣進行編號，分別為1～12號，室溫下風干10填。土樣風干可以大大降低細菌的數量。風干后，將土樣研成細粉狀，過100目篩，每份10克，備用。②土樣干熱。放線菌的孢子一般比非產芽孢的細菌抗熱性要強，120 ℃加熱1 h就會迅速減少細菌和部分鏈霉菌的數量，而小雙孢菌和鏈孢囊菌只有輕微減少。因此，將土樣在120 ℃恒溫箱中干熱處理1小時。

（3）放線菌分離培養。①土樣稀釋液配制。取潔凈試管48支，每4支為一組，共12組。每只試管加蒸餾水9 mL，121.3 ℃滅菌。先將1號土放入第一組試管的第一支中，震蕩混勻，待稍沉淀后，用1 mL無菌移液管取1 mL土壤懸液加入第二只試管中，震蕩搖勻后再取1 mL加入第三只試管，第四只類推。所以第三只、第四只試管分別是該土樣的103、104稀釋液。按上述方法，分別用12份土樣做成稀釋液。②放線菌分離培養。重鉻酸鉀能強烈抑制細菌和真菌的生長，而放線菌幾乎不受影響。在高氏一號瓊脂培養基每500 mL中加入重鉻酸鉀抑制劑0.4 mL，滅菌后倒平板。用1 mL無菌移液管分別吸取上步中103、104稀釋液0.2 mL，每種濃度的稀釋液涂2個平板，每一份土樣涂4個平板，總計48個平板。

將涂布好的平板在28 ℃恒溫環境培養7天，平板上長出各種放線菌菌絲，對每種土壤中放線菌的數量和種類進行統計。

（4）稀有放線菌的初篩。配制燕麥瓊脂培養基1800 mL，滅菌，分裝270個試管斜面。用接種針從前一階段涂布培養的平板上挑取形狀奇特、生長較小或產生色素的放線菌，將其接種在試管斜面上。每份土挑取10～20份菌，并編號，28 ℃恒溫培養7天。

（5）稀有放線菌的擴大培養。在燕麥瓊脂培養基平板上，將篩選出的稀有放線菌進行涂布，每種涂布兩個平板。每種再用兩個平板做埋片法培養，28 ℃恒溫培養7天，進行稀有放線菌的形態觀察及生理生化測定。①形態觀察。將用埋片法培養的放線菌蓋玻片取下，于載玻片上用光學顯微鏡和電子顯微鏡分別觀察形態特征和培養特征，形態特征記錄菌絲形態，氣生菌絲和基內菌絲生長情況；菌絲體是否產生孢子絲及孢子絲的排列方式、形狀；孢子絲形狀和大小；孢囊的有無、形狀、大小及形成方式等。培養特征記錄孢子絲、菌絲顏色及是否產生可溶色素。②生理生化測定。使用高氏一號瓊脂培養基、察氏瓊脂培養基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養基、貝奈特瓊脂培養基、酵母膏麥芽膏瓊脂培養基及無機鹽淀粉瓊脂培養基平板，用平板劃線法將分離出的稀有放線菌分別接種在以上平板上，每種培養基兩個，28 ℃恒溫培養7天，觀察放線菌在不同培養基平板上的生長狀況并作出統計。

3 實驗結果

3.1 分離培養結果

使用高氏一號培養基培養分離放線菌，28 ℃培養7天后，觀察到培養基上長滿各種放線菌菌落，直徑較小，大多數產生色素，見圖1。

圖1 分離出的土壤放線菌

取稀釋104倍的平板對每種土壤樣本放線菌菌落進行計數，并初步分類，見表1。

表1 每種土壤樣本放線菌數量和分類

表中Mim代表小單孢菌放線菌類群，Acm代表馬杜拉放線菌類群，Apl代表游動放線菌類群，Str代表鏈霉菌。

對表1中的數據進行分析，首先將12種樣本分為荒地、沙地、農作物地和普通植物地四種土壤類型，分別作其中放線菌含量和種類的統計，見表2。

表2 不同土壤類型放線菌含量和種類比例

由表2可以看出，荒地的土壤放線菌含量最高，達到130×104個/克土。農作物地和城市普通植物地的放線菌含量也較高，分別為84×104個/克土和31.33×104個/克土，而沙地中放線菌含量極微，只有5×104個/克土。原因是沙地土壤貧瘠，營養成分少，不利于放線菌生長。農村農作物地和城市中普通植物地由于肥料充分，放線菌生長較好。而城市荒地多為草皮覆蓋，有較多的養分積累，放線菌生長也較好。四種類型土壤中鏈霉菌占大多數，其次是小單孢菌類和馬杜拉菌類，游動放線菌類最少。并且后兩種菌類在沙地土壤中未檢出。

3.2 稀有放線菌初篩結果

用接種針挑取形狀奇特、生長較小或產生色素的放線菌，接種在燕麥瓊脂培養基試管斜面上。每份土挑取10～15份菌，編號，共挑取153個放線菌。恒溫培養后，對長成的放線菌進行鑒定，得到1株類似稀有放線菌，在5號土壤中，編號為01號菌。

3.3 稀有放線菌形態特征和生理生化性質

培養7天后，觀察各種菌在燕麥瓊脂培養基平板上生長情況如下：

氣生菌絲乳白色，茂盛。基生菌絲少，乳白色。無可溶色素。

將使用埋片法培養的01號菌種標本進行電鏡觀察，拍攝到的電鏡圖片如圖2所示。

圖2 01號放線菌掃描電鏡圖

將01放線菌制片后放光鏡下觀察，形態特征如下：

單軸分枝的氣絲上形成縱隊排列的雙孢子，孢子表面光滑，呈半球形，向內凹陷，交替生長在側枝兩側，經電鏡觀察，氣生菌絲直徑0.2 μm～0.3 μm。初步鑒定為小雙孢菌。

將01號菌分別在幾種常用培養基上用平板劃線法進行接種，28 ℃恒溫培養7天后，觀察在各平板上生長狀況如表3所示。

表3 01號放線菌在不同培養基上的生長狀況

4 結論

（1）從徐州地區土壤樣本分離出土壤放線菌，經分類統計其大多數屬于鏈霉菌類，有一部分小單孢放線菌類，有少量馬杜拉放線菌類和游動放線菌類。城市荒地和種植作物的土壤放線菌含量多，沙地放線菌含量稀少。

（2）從分離出的放線菌中得到1株稀有放線菌，經單菌種培養并電鏡鑒定為小雙孢菌類，可能為新種，需進一步分析。

（3）將此種菌分別在不同培養基上培養，發現在絕大多數培養基上長勢良好。