基于Wnt∕β-catenin通路探討益氣活血方對急性心肌梗死大鼠心肌損傷的修復作用

李偉藝， 劉紅松， 高山瑛， 蘇志強

（漢中市人民醫院中醫康復科，陜西漢中 723000）

急性心肌梗死（AMI）是臨床常見的心血管疾病，通常會危及患者生命，已成為全球嚴重的公共衛生問題[1-2]。AMI的病因復雜，與患者的生活方式、飲食習慣、遺傳因素、后天生存環境及機體病理生理狀態均密切相關[3]。發生AMI后，及時采用溶栓治療或經皮冠脈介入治療是縮小心梗面積并改善臨床結果的最佳、也是最有效的策略；然而，當前的臨床數據顯示，經皮冠脈介入治療及二級預防性治療后，患者的發病率和死亡率依然較高，且在恢復缺血心肌血流的同時極可能帶來再灌注損傷，導致心肌細胞死亡。因此，尋找有效的AMI治療及預防方法和藥物至關重要[4-5]。AMI屬于中醫學“胸痹”的范疇，為本虛（氣虛、陽虛）標實（痰濁、血瘀）病癥。益氣活血療法常被用于中醫臨床治療冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病[6-7]。本研究中的益氣活血方由黃芪、當歸、川芎、丹參4味藥材組成，具有補氣活血功效。本課題組前期臨床研究發現，益氣活血方治療AMI患者，能夠降低心肌損傷指標乳酸脫氫酶（LDH）、磷酸肌酸激酶（CK）、CK同工酶（CK-MB）的含量，提高左室射血分數。有研究表明，Wnt∕β-連環蛋白（β-catenin）信號通路與心腦血管疾病的發生發展密切相關，該信號通路的表達情況影響著心肌細胞的增殖、凋亡及炎癥水平，抑制該信號轉導途徑的表達往往可取得較好的治療效果[8-9]。因此，本研究以Wnt∕β-catenin信號通路為切入點，觀察益氣活血方對AMI大鼠心功能和結構的影響，探究其對AMI相關心肌損傷的修復作用及機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，6～8周齡，體質量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）2016-0006]。實驗單位：陜西中醫藥大學實驗動物中心[SYXK（陜）2021-001]。飼養環境：溫度20~25℃，濕度50%~65%，光照∕黑暗12 h交替。

1.2 藥物、試劑與儀器益氣活血方（黃芪30 g、當歸12 g、川芎15 g、丹參15 g，中藥飲片購自漢中市人民醫院），由漢中市人民醫院藥劑科制備成1.6 g∕mL的濃縮水煎液，4℃冰箱保存。Wnt-C59[Wnt∕β-catenin信號通路抑制劑，阿拉丁試劑（上海）有限公司產品，貨號：SJ015EF497158]；蘇木素-伊紅（HE）、Masson及脫氧核苷酸末端轉移酶（TdT）介導的核苷酸（dUTP）缺口末端標記法（TUNEL）染色試劑盒（博士德生物有限公司）；LDH、CK、CK-MB試劑盒（南京建成生物工程研究所）；反轉錄試劑盒、實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（RT-qPCR）預混液（美國Thermo Scientific公司）；引物（日本Takara公司合成）；Wnt3a、β-catenin、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、C-myc兔單抗（武漢三鷹生物技術有限公司）。電泳儀，購自北京六一儀器廠；多普勒超聲儀，購自美國Beckman公司；IX53型顯微鏡，購自日本奧林巴斯；多功能凝膠成像系統，購自美國Syngene公司；酶標儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 分組與造模將60只大鼠按照隨機數字表分為假手術組、模型組、中藥組、Wnt-C59組，每組15只。模型組、中藥組、Wnt-C59組大鼠按照文獻[10]方法，采用結扎冠狀動脈前降支法建立AMI模型，若心電圖可見Ⅱ導聯ST段較手術前抬高0.2 mV以上即可認為造模成功。經術后觀察，模型組、中藥組、Wnt-C59組大鼠各有14只、15只和14只造模成功。假手術組大鼠僅打開胸腔后縫合。各組大鼠均在造模后肌注4萬U青霉素預防感染。每日1次，共3 d。

1.4 給藥方法造模后第2天，中藥組大鼠灌胃6.48 g∕kg益氣活血方藥液，給藥劑量按照人和動物體表面積折算的等效劑量比率關系換算，Wnt-C59組大鼠灌胃30 mg∕kg Wnt-C59，假手術組和模型組大鼠灌胃20 mL∕kg 0.9%氯化鈉（NaCl）溶液，1次∕d，共4周。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 心功能指標檢測末次給藥后2 h，采用多普勒超聲儀檢測各組大鼠左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室收縮末期內徑（LVESD）和左室舒張末期內徑（LVEDD）。連續檢測3個心動周期，取其平均值。

1.5.2 標本制備完成心電圖檢查后，各組大鼠尾靜脈取血，于4℃冰箱靜置2 h，以3 000 r∕min（離心半徑為12.5 cm）離心10 min后取血清，用于酶聯免疫吸附分析（ELISA）檢測。處死大鼠，分離心臟，一部分心臟組織以40 g∕L多聚甲醛溶液固定，用于切片染色，余下的組織置于-80℃凍存，用于蛋白免疫印跡（Western Blot）和RT-qPCR檢測。

1.5.3 HE染色檢測心臟組織在40 g∕L多聚甲醛溶液中固定48 h后，蒸餾水清洗、梯度乙醇脫水后制作病理切片，切片厚度為4μm，脫蠟、復水后行HE染色，光鏡下觀察大鼠心肌組織病變。

1.5.4 Masson染色檢測組織固定、病理切片制作、脫蠟和復水過程同“1.5.3”項。按照Masson染色試劑盒的操作步驟進行染色，光鏡下觀察心臟組織纖維化情況。

1.5.5 TUNEL染色檢測組織固定、病理切片制作、脫蠟和復水過程同“1.5.3”項。嚴格按照TUNEL試劑盒的步驟對病理切片進行染色處理，并置于熒光顯微鏡下拍照記錄，計算凋亡指數（AI）。AI（%）=陽性細胞數∕總細胞數×100%。

1.5.6 RT-qPCR法檢測取大鼠心肌組織，研磨勻漿后加入TRIzol裂解液提取總RNA，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物序列見表1。反應條件：95℃5 min，95℃30 s、62℃30 s、72℃30 s，擴增40個循環，最后72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應。實驗重復3次。根據2-△△CT法計算目的基因mRNA相對表達量。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.7 ELISA法檢測取大鼠血清，嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測血清LDH、CK-MB、CK的含量。

1.5.8 Western Blot法檢測取大鼠心臟組織，研磨勻漿后提取組織蛋白并測定蛋白濃度（BCA法），加入loading buffer混勻、煮沸使蛋白變性。取適量蛋白上樣行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉膜后封閉2 h。然后將聚偏氟乙烯（PVDF）膜置于4℃環境下在Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、C-myc一抗稀釋液（1∶1 000）孵育12 h，TBST緩沖液清洗。再把PVDF膜置于羊抗兔IgG二抗稀釋液（1∶2 000）中37℃孵育2 h，TBST洗膜，均勻滴加適量發光液，放置于凝膠成像儀中顯影拍攝。以GAPDH為內參，以目的蛋白的灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.6 統計方法采用SPSS25.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析（One way ANOVA），兩樣本比較采用LSD-t檢測方法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標比較表2結果顯示，模型組大鼠心功能指標LVEF和LVFS均低于假手術組，LVESD和LVEDD均高于假手術組（P＜0.05），而中藥組、Wnt-C59組LVEF和LVFS值均高于模型組，LVESD和LVEDD值均低于模型組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠心功能指標比較Table 2 Comparison of cardiac function indexes of rats in various groups （±s）

表2 各組大鼠心功能指標比較Table 2 Comparison of cardiac function indexes of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組中藥組Wnt-C59組LVFS（%）42.55±3.39 16.68±2.25①24.32±2.48①②24.79±2.26①②鼠數（只）15 14 15 14 LVESD（mm）4.53±0.79 9.20±1.37①7.09±1.14①②7.16±1.20①②LVEDD（mm）6.90±0.95 10.49±1.39①8.55±1.19①②8.64±1.21①②LVEF（%）78.69±4.72 38.57±2.09①55.10±3.13①②56.67±3.01①②

2.2 各組大鼠心肌組織病理學變化比較圖1結果顯示，假手術組心肌組織結構正常、完整，心肌細胞分布均勻、有序，輪廓清晰可見，胞核與胞質邊緣分明，血管管腔完整，部分血管周圍有少量呈藍色的膠原組織。與假手術組比較，模型組心肌組織HE染色著色較淺，有細胞輪廓不清晰和細胞破碎現象，組織的排列呈異常紊亂、無序狀，并伴有炎癥細胞浸潤，Masson染色顯示紫紅色的心肌組織明顯減少，存在大量呈藍色的膠原纖維，血管破碎，部分血管呈管腔狹窄和閉合。與模型組比較，HE染色顯示中藥組和Wnt-C59組心肌組織排列較為整齊，著色相對更均勻，有少量炎癥細胞浸潤，血管管腔完整度較好，Masson染色顯示中藥組和Wnt-C59組以紫紅色心肌組織為主，藍色膠原纖維沉積現象顯著減輕。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化比較（HE染色法，×400；Masson染色法，×400）Figure 1 Comparison of pathological changes of myocardial tissue of rats in various groups（by HE staining，×400；by Masson staining，×400）

2.3 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較圖2結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞幾乎無凋亡，偶見胞核呈棕褐色的陽性染色細胞，而模型組大鼠心肌細胞AI值及陽性染色細胞數量均顯著高于假手術組（P＜0.05），中藥組、Wnt-C59組大鼠心肌細胞AI值及陽性染色細胞數量均顯著低于模型組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較（TUNEL法，×400）Figure 2 Comparison of apoptosis of rat myocardial cells in various groups（by TUNEL，×400）

2.4 各組大鼠心肌凋亡相關基因mRNA表達水平比較圖3結果顯示：模型組大鼠心肌Caspase-3、Bax mRNA表達水平顯著高于假手術組，Bcl-2 mRNA表達水平顯著低于假手術組（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和Wnt-C59組Caspase-3、Bax mRNA表達水平降低，Bcl-2 mRNA表達水平升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠心肌凋亡相關基因mRNA表達水平比較Figure 3 Comparison of mRNA expression levels of rat myocardial apoptosis-related genes in various groups

2.5 各組大鼠血清LDH、CK、CK-MB含量比較圖4結果顯示，模型組大鼠血清LDH、CK、CK-MB的含量均顯著高于假手術組（P＜0.05），中藥組和Wnt-C59組血清LDH、CK-MB、CK含量均顯著低于模型組（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠血清心肌損傷指標比較Figure 4 Comparison of serum myocardial injury indexes of rats in various groups

2.6 各組大鼠心肌組織Wnt∕β-catenin通路相關蛋白表達比較圖5結果顯示，模型組大鼠心肌組織Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、C-myc蛋白表達水平均顯著高于假手術組（P＜0.05），中藥組和Wnt-C59組Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、C-myc蛋白表達水平均顯著低于模型組（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠心肌組織Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達比較Figure 5 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathway-related protein expression in myocardial tissue of rats in various groups

3 討論

急性心肌梗死（AMI）屬于中醫學“胸痹”的范疇。年老體衰、飲食不節、寒邪內侵等均為其病因，基本病機為心脈阻閉不通，心失所養。本病病性為本虛標實，本虛指氣虛、陽虛、陰虛，以心氣虛為主；標實為痰濁、血瘀、氣滯、寒凝，以血瘀為主[11]。氣虛血瘀為該病的主要病機，因氣虛而導致氣血運行不順，血停則瘀，抑或氣血生化不足，氣血運行中斷，觸發本病，因此，“益氣”是治療AMI的主要原則。臨床研究表明，具有活血化瘀、行氣開郁的中藥方劑在治療AMI時常能取得顯著療效，聯合西醫治療也成為當前AMI治療的常用方案[12-13]。本研究所用的益氣活血方中，黃芪為君藥，溫陽補氣，當歸為臣藥，可“破惡血、養新血”，川芎和丹參活血、行氣、祛瘀，能祛風、通經、止痛，諸藥相互為用，共奏補氣活血之功效[14]。

LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD是臨床治療中用于評價心臟功能的常用指標。AMI發生后，心臟的收縮力和舒張力顯著降低，這些改變歸因于心室壁局部缺血[15]。本研究結果顯示，模型組大鼠心臟功能顯著降低，有明顯心室擴張和重構，益氣活血方可改善大鼠心臟功能，減輕心室擴張。與細胞損傷和功能完整性喪失有關的LDH、CK、CK-MB等指標是評估心肌損傷和充血性心力衰竭的重要心肌酶，已被應用于臨床診斷心肌梗死性疾病[16]。本研究結果顯示，模型組LDH、CK、CK-MB含量均顯著增加，益氣活血方降低血清LDH、CK、CK-MB含量，可改善模型大鼠心肌損傷，減輕心肌組織膠原纖維沉積。另外，模型組大鼠心肌細胞凋亡顯著，而益氣活血方能夠減輕細胞凋亡，且這一現象在Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達的檢測中得到驗證。Bcl-2家族高度嚴格調控人體正常細胞和惡性細胞的死亡過程，其中包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡的效應蛋白Bax，Bcl-2和Bax可共同激活促凋亡蛋白Caspase-3及Caspase家族的其他因子，引起衰老和凋亡的發生[17]。本研究結果顯示，模型組心肌Caspase-3、Bax mRNA表達水平升高，Bcl-2 mRNA表達水平降低，益氣活血方可下調Caspase-3、Bax mRNA水平，上調Bcl-2 mRNA水平，提示益氣活血方可減輕AMI導致的心肌損傷和細胞凋亡。

Wnt信號通路最初在癌癥過程中被發現，其可調控人類和動物的多種病理生理過程，激活不同信號轉導途徑[18]。經典Wnt信號通路的功能異常與心臟疾病相關，如AMI、肥厚、心力衰竭、心律不齊及動脈粥樣硬化等[19]。β-catenin是一種調節細胞轉錄和基因表達的蛋白，該因子的過度表達可加劇心臟損害，并惡化左心室收縮功能，抑制該通路可抑制心臟損傷后的纖維化過程，預防心力衰竭，因此，針對該信號通路的抑制措施被認為是具有心臟保護作用的[20-21]。本研究結果顯示，模型組心肌Wnt3a、β-catenin的表達被顯著上調，β-catenin靶基因Cyclin D1、C-myc蛋白表達也隨之上升，益氣活血方則抑制了Wnt3a、β-catenin表達，β-catenin的靶基因Cyclin D1、C-myc蛋白表達也隨之減少。為了進一步探究益氣活血方的作用機制，本課題組在實驗中同時設立了Wnt-C59對照組。Wnt-C59是一種特異性針對Wnt信號通路的小分子化合物，可逆轉激活的Wnt∕β-catenin信號通路，在腫瘤及心臟疾病中有顯著作用，且治療劑量下無明顯毒性[22]。結果顯示，Wnt-C59不僅抑制了Wnt∕β-catenin信號通路的活化，同樣也改善了大鼠心臟功能，減輕心肌損傷和心肌細胞凋亡，降低血清心肌損傷指標LDH、CK、CK-MB的含量，益氣活血方的作用效果與Wnt-C59相似，進一步提示益氣活血方可能通過調控Wnt∕βcatenin途徑發揮對AMI大鼠心肌損傷的修復和改善作用。

綜上所述，益氣活血方可改善AMI后引起的大鼠心肌損傷，其機制可能與調控Wnt∕β-catenin途徑有關，而該調控過程中是否有其他相關信號通路的參與，仍需要進一步的研究。