土壤中抗生素類物質的分析研究進展

呂振娥

(烏魯木齊市米東區農產品質量安全檢測中心，新疆 烏魯木齊 830000)

1 抗生素污染及監測研究現狀

1.1 醫藥品和個人護理品引發的環境問題

一般來說，日常生活中經常使用的化學產品如醫藥品、化妝品等統稱為“醫藥品和個人護理品”，即PPCPs。對于醫藥品，目前大約有4500種被廣泛使用，而個人護理品的全球年生產量也已超過106t，因此PPCPs成為了一類“新型”化學物質，且呈現出一種持續存在的狀態，被科學家們稱為“虛擬持久性化學物質”[1]。

PPCPs被源源不斷地輸入環境，導致其在環境中的殘留量不斷增大，最終可能危害到人類的生產生活以及生態環境安全。但目前人類對其認識還非常有限，因此有必要對其存在現狀進行更廣泛和深入的研究。由于PPCPs自身存在種類繁多、半衰期短和濃度低等特點，使建立同等條件下高靈敏、高特異性的多種污染物類別的同時檢測分析方法成為PPCPs研究領域的一個關鍵。

1.2 環境中抗生素的來源及負面效應

1.2.1 環境中抗生素的來源

抗生素屬于眾多的PPCPs類物質中使用較為廣泛的醫藥品類，其能引起抗藥病原菌的選擇性存活，目前已受到學術界的廣泛關注。1940年以來，抗生素被大范圍使用，主要用于預防和治療疾病或者促進動物生長。臨床常用的類別主要包括四環素類、β-內酰胺類、喹諾酮類和磺胺類等。

目前，全球每年使用的各種抗生素總量已超過20萬t[2]。1999年，歐盟和瑞士用于人體健康和動物疾病、生長促進作用的抗生素用量分別達到8637.2t和3853.5t[3]。統計顯示，美國從1995—2002年，喹諾酮類和磺胺類抗生素位于前200種最經常用的處方藥之中，而我國在2003年，青霉素和土霉素的生產量占到了世界總產量的60%和65%[1]。在我國醫院使用量與銷售量排名中，前15名藥物中有10種均為抗生素。因此，過度使用抗生素的現象已經非常普遍。

抗生素經人體或動物攝入后，85%以原形或代謝產物的形式排放進入環境[3]。由于絕大多數的抗生素具有極性高的特點，因此水環境中的抗生素普遍存在。在污水處理過程中，一些抗生素類物質無法被有效去除，從而排入天然水體；人類丟棄或者動物等攝入后排出的抗生素可能通過施肥等各種途徑進入土壤；通過水循環，地表水體、土壤等介質中的抗生素可能污染到飲用水；另外，企業廢水特別是制藥廠、養殖業廢水的無監管亂排現象也是不容忽視的。目前在水體、食品、沉積物、動物糞便以及土壤中都廣泛地檢出了抗生素殘留[3]。

1.2.2 抗生素的危害

抗生素的過度使用會增強一些細菌等微生物的耐藥性，而隨著耐藥微生物的不斷增多，其最終將成為環境中的優勢菌并不斷繁殖，即使環境中的抗生素污染可以消除，已經形成的耐藥微生物仍然會在環境中持續存在，從而威脅到人類的生存環境。

目前，四環素、磺胺、β-內酰胺等抗生素的耐性微生物已經廣泛出現于污灌土壤、污水處理廠出水、河道沉積物，甚至飲用水中，且在新研制的抗生素中也存在這種情況，如喹諾酮類抗生素[4]。據統計，2001年美國醫院50%～60%的感染均源于耐藥菌。在1994—2008年，荷蘭土壤中抗生素耐藥基因的水平最高達到20世紀70年代的15倍[5]。同時，耐藥微生物不僅表現為對某一種抗生素產生耐藥性，某些菌株甚至可以同時對100多種抗生素產生耐性。此外，耐藥基因還可以發生重組、水平轉移，繼而在環境中傳播[5]。

除耐藥性外，環境中低濃度抗生素的持續存在還會對水生生物、植物、動物產生遺傳毒性、慢性毒性和致癌性等生態毒性，并影響環境中各種微生物的數量和種類結構，從而破壞原本和諧的生物之間的聯系和平衡。雖然目前抗生素的生態風險評價均是基于有限的監測和對生物的毒理數據，但已經初步表明其對生物圈具有一定的危害。

1.3 環境中抗生素類物質的監測現狀

1.3.1 抗生素的儀器分析方法

抗生素的殘留分析最早于20世紀90年代開始，氣相色譜-質譜(GC/MS)是當時最主要的分析手段。由于大多數藥物具有不易揮發或熱不穩定的特點，因此使用GC/MS檢測環境中的抗生素存在一定的限制因素。

近年來，對于多組分抗生素殘留的分析多采用高效液相色譜(HPLC)，而檢測器除了紫外、熒光時有應用，質譜尤其是串聯質譜由于具有較高選擇性和靈敏性已成為主流的定性和定量手段[6]。在質譜的使用過程中，離子源的選擇是很重要的。大氣壓化學電離(APCI)基質效應小，但實際環境中的抗生素殘留濃度往往是痕量，因此偏低的靈敏度使其在檢測中受到一定限制。而ESI源雖然受基質影響較大，基質干擾會減少離子化效率，使基線升高，方法靈敏度降低，可能導致檢測結果錯誤，但由于其對極性、弱極性及熱不穩定性物質良好的適用性，成為了抗生素分析中最頻繁使用的離子化方式。因此，LC-MS/MS分析中一個典型的問題就是基質效應。在提取或富集濃縮目標物質時，往往會共存大量的雜質，而且這種抑制作用不但在復雜介質如土壤和沉積物中存在，甚至分析飲用水中也存在(四環素、磺胺、喹諾酮)。

對于基質效應，目前部分研究者通過使用內標法定量、同位素標記以及減少進樣量的方法以使結果更可靠，但內標法太耗時，同位素標記內標太昂貴且不易購買，因此大部分研究者并未提及此類問題，也尚未有明確的解決方案。近年來四極桿串聯飛行時間質譜(QTOF)逐漸被用于藥品的環境分析中，其可以同時對近百種藥物進行檢測，具有更佳的定性能力。隨著人們對環境分析的準確度的不斷提高，開發更加靈敏的不同種類多組分殘留分析技術已成為抗生素環境分析領域的必然趨勢。

1.3.2 環境中抗生素樣品制備方法

樣品制備的主要目的是分離出非目標物質，使目標物質的純度和濃度得到提高，為后續的儀器分析做好準備，因此樣品的物化性質以及基質性質就成為了樣品前處理的重要影響因素。樣品制備過程包括酸堿度的調整、萃取過程中加入螯合劑、對萃取液進行處理以及為色譜分析進行的準備工作等。

有文獻報道，四環素類(TCs)和氟喹諾酮類(FQs)抗生素可與環境中的二價金屬離子形成復雜螯合物，從而不可逆地吸附在固相萃取柱上或者黏附在玻璃器皿上。因此，需要向環境樣品中加入螯合劑，如乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、草酸或檸檬酸，以去除干擾、改善峰形，其中Na2EDTA是最常用的手段。此外，實驗過程中使用稀硝酸浸泡玻璃器皿也是改善回收率的方法之一。

對于環境中抗生素的富積凈化，固相萃取(SPE)因具有速度快、穩定性好、綠色環保等優點而成為主流方法。在固相萃取柱的選擇上，有文獻研究[7]將親水親油平衡HLB柱、強陽離子交換MCX柱和C18柱進行對比，結果發現,MCX柱對酸性物質具有較好保留效果，但對于堿性和中性化合物，回收率則偏低，因此為了高效率地萃取堿性物質，樣品的pH值必須調低；C18柱對于大多數物質都是適用的，但含有自由硅醇基團，會與四環素類抗生素發生不可逆的結合，從而降低富集效率。Lindsey等通過比較4種固相萃取柱(500mg C18、150mg ENV+、60mg HLB、500mg HLB)分析水體中6種磺胺和5種四環素的富積效果，結果顯示，四環素類不能從C18和ENV+柱上洗脫下來。因此，HLB柱(由親脂烷酮的二乙烯基苯和親水的N-乙烯基吡咯烷酮2種單體按比例聚合而成)較其它萃取柱具有更高的萃取效率，pH(1～14)范圍也更廣，適用于所有物質，美國EPA對74種醫藥品的富集均是采用的HLB柱。但是，HLB柱會富集大量的雜質，近年來部分研究者采用串聯SPE柱，如C18-HLB、SAX-HLB等，通過串聯柱的進一步凈化成為了降低基質效應的方法之一。

固體樣品中抗生素的前處理較水體中的多一個提取步驟，目前提取方法有微波輔助(MAE)、加壓溶劑萃取(PLE)、震蕩-超聲、加速溶劑萃取(ASE)等，其中最常用的是超聲-震蕩-離心和ASE 2種提取方法。在提取液的選擇方面，通常采用緩沖液如磷酸、McIlvaine(檸檬酸與磷酸鹽混合液，pH 4～6)、檸檬酸等與一定比例的有機溶劑如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等混合。如，EPA關于固體介質中醫藥品提取的標準方法是選用磷酸鹽緩沖液(pH=2)和乙腈，回收率在20%～260%。固體樣品提取液經過進一步的固相萃取富集后再進行測定，HLB柱仍然是最常使用的固相萃取柱。馬麗麗等[7]對比了ProElut C18、HyperSep Retain PEP、HyperSep C18和Oasis HLB 4種反相萃取柱對土壤中四環素、磺胺和喹諾酮的富集效果，結果表明，以聚合物為填料的HyperSep Retain PEP柱和Oasis HLB明顯較硅膠鍵合的C18柱所得到的回收率高，而同時提取這3類抗生素時，Oasis HLB的效果最好。但目前固體介質中分析的物質和手段還很有限，提取效率和基質效應是一個重要的制約因素。

1.4 環境中抗生素殘留研究進展

目前，關于城市污水處理廠[8]進出水中抗生素殘留情況的報道層出不窮，范圍涵蓋了歐洲、北美、非洲和亞洲部分國家，其中最頻繁報道的幾種抗生素類物質主要是SMX(20～870ng·L-1)、TMP(7～1340ng·L-1)、CIP(20～600ng·L-1)、OFL(20～600ng·L-1)、NOR(30～120ng·L-1)和ERY(15～2054ng·L-1)。且關于地表水體中抗生素的濃度水平在美國、德國、英國和巴西等已經廣泛報道。Kolpin等較全面地分析了美國30個州內139多條河流水中農藥、醫藥、獸藥、激素等95種有機污染物，其中抗生素濃度均在μg·L-1級[9]。而在我國珠江、香港和海河流域中抗生素的濃度在3～410ng·L-1。飲用水作為直接暴露途徑，與人們的健康息息相關，USGS在2000年和2001年對本國飲用水源的普查時檢出了SMX、TMP、SMA、ERY、CIP等抗生素類物質，濃度水平最高已達到1110ng·L-1[10]。

已有的研究表明，不同種類抗生素在土壤環境中的濃度范圍在0.1～2683.0μg·kg-1，其中土霉素在土壤中的殘留量最大。加拿大土壤環境中四環素濃度可達到52μg·kg-1，我國北方土壤中四環素和金霉素的殘留濃度分別為20.9～105.0μg·kg-1，33.1～1079.0μg·kg-1[11,12]。西班牙農田土壤中磺胺類抗生素的平均濃度為0～50.53ng·g-1[13]，美國施用糞肥土壤中檢測到磺胺甲惡唑的濃度為34.5～663ng·kg-1[14]。氟喹諾酮在土壤中的殘留濃度范圍在μg·kg-1～mg·kg-1，東莞蔬菜地4種喹諾酮的檢出率均為90%以上，總含量為0～554.1μg·kg-1，瑞士施用城市污泥土壤中諾氟沙星和環丙沙星含量分別為0.27～0.4mg·kg-1和0.27～0.32mg·kg-1[15]。目前的研究中，施肥后土壤中檢測到四環素類、磺胺類和喹諾酮類抗生素的最大濃度依次為0.3mg·kg-1、0.015mg·kg-1和0.37mg·kg-1[17]。由此可見，不同地域、不同類型土壤中抗生素的含量差異較大。

2 抗生素污染及監測研究現狀小結

抗生素作為PPCPs的一大類，已經被研究了10a多，尤其是水環境中的抗生素環境污染得到了廣泛的關注，但關注的物質仍十分有限。而有關固體介質如土壤中抗生素的殘留情況的報道還相對較少，此外，關于其進入環境的代謝產物的研究還十分匱乏。由于土壤環境相對較復雜，分析方法的有限性可能是限制當前土壤中抗生素環境研究的一個重要原因。這種限制性著重體現在樣品的有效前處理和分析的靈敏度上，這類物質在環境中普遍濃度低，且極易受到基質干擾。因此，需要建立一種可以同時檢測多種抗生素物質包括其代謝產物在內的分析方法，檢測盡量多的物質，從而系統全面地探析這類物質的環境污染特征，為研究其風險及以環境管理策略提供依據。特別是作為一個抗生素的生產和使用大國，我國環境中抗生素的種類、濃度水平和環境影響可能和別國有所不同。