分子生物學技術在植物病毒檢測中的應用

董芳娟 魏增云 薄一覽

(忻州師范學院，山西 忻州 034000)

植物病毒在全球范圍內的危害越來越大，植物病毒能夠導致農作物和經濟作物發(fā)病，造成產量下降甚至絕收的情況出現(xiàn)，給農業(yè)帶來極大的損失。近年來，發(fā)現(xiàn)的植物病毒種類越來越多，當前發(fā)現(xiàn)的植物病毒分為18個科，共76個屬，總數(shù)量超過1000種。隨著我國與國際貿易規(guī)模不斷擴大，境外植物病毒通過口岸的輸出風險不斷擴大，因此加強植物病毒的檢測效率和準確性就顯得更為重要。為了防止植物病毒的危害，需要做好病毒預防和綜合防治工作，而建立快速、高靈敏度、高通量的病毒檢測體系是做好上述工作的前提。植物病毒的檢測技術經歷了多年發(fā)展，起初常用的檢測技術包括生物學鑒定和電子顯微鏡技術，隨后酶聯(lián)免疫吸附反應成為植物病毒常用的手段。隨著分子生物學的發(fā)展，在植物病毒檢測領域，分子生物學方法已經獲得了廣泛的應用，包括核酸雜交技術、反轉錄PCR技術、熒光定量PCR技術和DNA微陣列技術等，本文對這幾種技術及其在植物病毒檢測領域的應用進行介紹。

1 核酸雜交技術

根據堿基互補配對原理，互補的核酸單鏈可以相互結合，核酸雜交技術就是利用了這一原理，通過對一段病毒特異的核酸序列進行標記，制成探針，將其和待測樣品的核酸進行雜交，若發(fā)生雜交則表示病毒存在。這種方法可以應用于DNA、RNA病毒及類病毒的檢測，該方法具有較高的靈敏度，同時還具有特異性強、通量高等方面的優(yōu)點。在實際應用中，為了滿足病毒檢測的實際需求，既可以制備用于單一病毒檢測的單特異性探針，也可以制備用于多種病毒檢測的復合型探針。當前核酸雜交技術在植物病毒檢測領域已經獲得了廣泛應用，包括核酸斑點雜交技術、核酸狹縫印跡雜交技術和Northem印跡等技術，在植物病毒檢測方面都有重要應用。研究人員對核酸雜交技術在植物病毒檢測方面的應用進行了大量的研究，Brown等對核酸斑點雜交技術、狹縫印跡技術和Northern印跡技在植物病毒檢測中的應用方法進行了全面的介紹，詳細描述了分析的過程和試驗步驟，構建了完善的檢測體系；Cohen等制作了一個針對柑橘樹上啤酒花矮化類病毒、柑橘裂皮類病毒、柑橘曲葉類病毒和柑橘類病毒Ⅲ號的復合探針，該探針能夠對上述病毒進行準確檢測，具有較高的靈敏度和效率。核酸雜交技術還可以進行植物病毒的鑒定，通過應用反向斑點雜交技術對待測樣品的病原物進行雜交，可以對病毒進行鑒定，如Hsu等就利用這一技術實現(xiàn)了馬鈴薯Y病毒組病毒的鑒定。

2 反轉錄聚合酶鏈式反應

反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術能夠完成多數(shù)植物病毒的檢測和診斷，該檢測方法的步驟和原理是進行RNA的反轉錄，使其轉錄成cDNA；通過1對特異性引物來進行PCR反應，對植物病毒進行檢測；引物的設計是該方法的重點，可以根據病毒核酸基因組序列來進行引物設計。研究人員對RT-PCR技術在植物病毒檢測中的應用進行了大量研究，Aparieio等通過應用RT-PCR對油桃中的李壞死環(huán)斑病毒進行了檢測，根據病毒的特異性和旋基因組序列設計了一堆特異性引物。通過RT-PCR擴增得到特異性產物，實現(xiàn)了李壞死環(huán)斑病毒的檢測，同時該實驗表明，花粉粒也能夠傳播病毒；Uga等采用RT-PCR完成了菜豆黃花葉病毒的檢測，該方法在獲得樣品的提取液之后，對粗汁液進行稀釋，然后進行電泳，最終得到了1條644bp的特異性條帶，完成了病毒檢測。實驗結果顯示，在稀釋106倍之后，稀釋液中仍然可以檢測出病毒，說明該方法具有非常好的靈敏度；Grisoni等應用RT-PCR方法對香草中的馬鈴薯Y病毒進行檢測，其對40個香草樣品進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)有36個樣品在327bp處出現(xiàn)了特異性條帶，即有36個香草樣品中攜帶了馬鈴薯Y病毒。當前，RT-PCR技術還在不斷發(fā)展之中，研究人員對RT-PCR技術進行了創(chuàng)新和改進，出現(xiàn)了一些新的RT-PCR技術，包括嵌套式RT-PCR技術、免疫捕獲RT-PCR技術和多重RT-PCR技術等，這些技術在植物病毒檢測中都有重要應用，現(xiàn)對這幾種技術的研究進行簡單介紹。在嵌套式RT-PCR技術研究方面，Morris等應用這一技術實現(xiàn)了甜菜壞死黃脈病毒的檢測，相較于傳統(tǒng)的RT-PCR技術，這一技術的靈敏度高得多，可以達到傳統(tǒng)RT-PCR技術的1000倍；Foissac等應用這一技術實現(xiàn)了果樹中蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖溝病毒等7種病毒的檢測，該實驗表明，嵌套式RT-PCR技術在同時檢測多種病毒方面具有良好的效果。免疫捕獲RT-PCR技術研究方面，Cook等應用這一技術實現(xiàn)了花生褪綠黑斑病毒的檢測，該方法的具體流程是應用馬鈴薯Y病毒屬的單克隆抗體對PCR管進行包被，并對樣品進行處理；然后將處理好的樣品加入到PCR管內，捕獲病毒作為模板進行反轉錄和PCR擴增，最終得到1條624bp的產物條帶，成功檢測了花生褪綠黑斑病毒。Teycheney等則綜合應用了嵌套式RT-PCR技術和免疫捕獲RT-PCR技術，通過這2項技術的聯(lián)合應用，對香蕉輕型黃葉病毒進行了成功檢測，該方法采用了抗BanMMV的多克隆抗體進行反應管的包被，并進行病毒的捕捉，然后以捕獲的病毒為模板進行嵌套RT-PCR反應，成功實現(xiàn)了病毒的檢測。在多種RT-PCR技術研究方面，Sanehez-Navarro等應用這一技術實現(xiàn)了8種核果類果樹病毒的檢測，應用該方法進行病毒檢測，不僅具有較強的靈敏度，而且具有良好的特異性。總的來說，通過應用改進和創(chuàng)新了的RT-PCR技術，相較于傳統(tǒng)的RT-PCR技術，在檢測效率、靈敏度等方面都有不錯的提升。因此，對RT-PCR技術進行進一步的研究，對于提高植物病毒的檢測效率具有重要意義。

3 熒光定量PCR

熒光定量PCR技術是一種利用熒光實時信號，對整個PCR過程進行實時監(jiān)測的PCR檢測技術，該技術能夠利用標準曲線實現(xiàn)未知模板的定量分析。熒光定量PCR技術是PCR檢測技術重要的進步，該技術的出現(xiàn)使得PCR技術不僅僅是一項定性分析技術，而且可以進行定量檢測。熒光定量PCR技術能夠在反應管內進行，條件簡單，可以用于大規(guī)模樣品檢測，同時該技術具有良好的特異性，受污染問題的影響小，而且該檢測方法的自動化程度較高，因此該方法在病毒檢測領域具有良好的應用前景。隨著熒光定量PCR技術的發(fā)展，在植物病毒檢測領域也獲得了重要應用。如，Mukasa等利用熒光定量RT-PCR技術，對甘薯輕型斑駁病毒、甘薯褪綠矮化病毒和甘薯羽狀斑駁病毒在甘薯植物中復合侵染及相互作用進行了鑒定；Bright等應用熒光定量PCR技術進行馬鈴薯塊莖中的馬鈴薯A病毒、馬鈴薯X病毒和馬鈴薯Y病毒的檢測，實現(xiàn)了這些病毒的定量檢測；Bertolini等應用熒光定量PCR技術實現(xiàn)了植物組織中柑橘速衰病毒的定量檢測。該方法相較于免疫捕獲RT-PCR技術，在靈敏度方面要高得多，可以達到免疫捕獲RT-PCR技術的1000倍，因此這一技術具有良好的應用前景。鄭耘等應用這一技術，實現(xiàn)了煙草環(huán)斑病毒的檢測，該方法具有較高的靈敏度。

4 DNA微陣列技術

DNA微陣列技術是結合了眾多學科的核酸固相雜交技術，該技術中應用了分子生物學、材料科學、信息科學和計算機科學等知識，當前這種技術在核酸序列測定、基因突變檢測、基因表達情況分析、微生物病原菌檢測、疾病診斷和藥物開發(fā)和篩選等方面都有重要應用。在植物病毒領域，DNA微陣列技術也有著重要應用。最早應用DNA微陣列技術檢測植物病毒的是Lee團隊，該團隊應用DNA微陣列技術對黃瓜綠斑駁病毒等引發(fā)葫蘆科植物病毒病的病毒進行了檢測，具有良好的特異性和靈敏度。馬新穎等利用基因芯片技術，成功檢測了郁金香中的煙草脆裂病毒，在該實驗中，TEV探針位置產生了較強的熒光信號，表明該郁金香種含有煙草脆裂病毒。

5 PCR-單鏈構型多態(tài)性

PCR-單鏈構型多態(tài)性(PCR-SSCP)是一種檢測突變技術，在不同地理區(qū)間下細菌、真菌以及病毒等的差異研究方面具有重要應用，該技術具有簡單、快速和成本低等方面的特點。該技術的原理是進行靶DNA的PCR擴增，然后對單鏈DNA的多態(tài)性進行分析。在SS-CP凝膠中電泳時，單鏈DNA的二級空間結構將直接決定其泳動的速率，基于這一原理，如果DNA片段中有堿基出現(xiàn)了突變，則該DNA片段的二級空間結構也會發(fā)生變化，這樣SS-CP的凝膠電泳結果會出現(xiàn)異常移動的電泳帶；使DNA通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過對其電泳位置進行分析，可以判斷出DNA片段上出現(xiàn)突變的堿基。這種方法也存在一定的缺陷，即其重現(xiàn)性比較差，因此檢測結果并不穩(wěn)定，同時也無法實現(xiàn)全部變異點位的檢測。相關學者對PCR-SSCP的實際應用進行了研究，如劉升學等利用這一方法對新疆甜菜壞死黃脈病毒進行了檢測，研究顯示，來自新疆不同地區(qū)的病毒可以分析4個變異類型，即在新疆地區(qū)甜菜壞死黃脈病毒出現(xiàn)了分化，且這種分化具有明顯的地域分布性。

6 差異顯示PCR技術

差異顯示PCR技術最早被提出是在1992年，這種技術的優(yōu)點是快速、簡單、靈敏度高，同時還能夠完成低豐度mRNA的分析，由于具有這些方面的優(yōu)點，使其在植物基因表達和克隆新基因等方面都獲得了重要應用。當前，差異顯示PCR技術已經成為研究基因表達的重要手段，這一技術的原理是利用一系列的引物來實現(xiàn)真核生物中全部表達mRNA的逆轉錄，然后利用PCR擴增轉換成cDNA，利用凝膠電泳實現(xiàn)具有差異的DNA片段的分離，從而完成目的基因的篩選。當前，差異顯示PCR技術在植物病毒檢測方面也有重要應用，還可以通過其對抗病機理進行研究。如，Benito等就應用差異顯示PCR技術對番茄真菌病害的機理進行了分析，研究結果表明，受到真菌侵染或者是遭到煙草枯斑病毒感染的番茄葉，與健康番茄葉相比，mRNA存在比較大的差異。植物被病菌入侵之后，植物防衛(wèi)基因會產生一系列的mRNA，然后產生蛋白來殺滅病菌；葉楠等應用差異顯示PCR技術對大豆疫霉根腐病菌進行了研究，選擇46種優(yōu)良大豆品種和大豆疫霉生理優(yōu)勢小種1號菌株進行研究，研究其非親和互作中前后基因表達的差異，通過相關研究，從大豆基因中分離出9條與大豆疫霉根腐病抗病性相關的cDNA片段，同時對大豆疫霉根腐病菌的分子抗病機制進行了進一步的分析，明確了抗病機制。

7 結語

植物病毒會導致農作物和經濟作物發(fā)病，造成減產甚至絕收，給農業(yè)帶來巨大損失。因此，加強植物病毒的防范非常重要，而對植物病毒進行檢測是進行植物病毒防治的基礎。隨著分子生物學技術的發(fā)展，其在植物病毒檢測領域得到了廣泛的應用，核酸雜交技術、反轉錄PCR、熒光定量PCR、DNA微陣列等分子生物學檢測技術在植物病毒檢測中應用越來越多，該技術具有檢測速度快、特異性好、靈敏度高和通量高等特點，對于提高植物病毒檢測的效率和準確性具有重要意義，可以準確、高效地完成植物病毒的檢測。