替加環素脂質體的制備工藝研究

徐艷艷，鄭麗君，張霞燕，吳振波，朱延焱，王海翔，田吉來

(1.麗水市中心醫院，浙江 麗水 323000；2.中國藥科大學工學院，江蘇 南京 211198；3.南京中醫藥大學醫學院·整合醫學學院，江蘇 南京 210023)

替加環素(tigecycline)，化學名為((4S,4aS,5aR.12aS)-4,7-雙(二甲氨基)-9-[(叔丁基氨基)乙酰氨基]-3,10,12,12a-四羥基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氫并四苯-2-甲酰胺，是由美國惠氏公司研制的一種具有超廣譜抗菌活性的新型甘氨酰環素類抗生素[1-2]，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌具有廣泛抗菌活性，尤其對鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌等具有很好作用[3-4]。替加環素為橘黃色粉末狀物質，是一種水溶的弱酸性化合物，logP為1.677 40。替加環素不穩定，其水溶液在空氣中易發生氧化降解和差向異構化，加熱和攪拌會加速其反應進行，差向異構化后的替加環素不再具有抗菌活性[5-6]。替加環素需要被保存在-60 ℃中。另外目前市面上替加環素以凍干粉針劑為主要劑型，存在靶向性不強、無法通過血腦屏障等缺點，在治療顱內感染時療效較差。

提高藥物穩定性一般有環糊精包埋、PEG分子修飾、平衡離子成鹽、藥物分子框架技術、做成其他載藥體系(如微囊、脂質體、膠束等)等方法[1]。其中，脂質體是在20世紀60年代發現的一種具有脂質雙分子層的超微球形載體制劑。脂質體可以將藥物包裹在內水相或者脂層，防止藥物受外界環境影響而降解。除此之外，它還具有如下特點:①通過修飾脂質體表層可以達到靶向治療作用；②修飾后可以避免被網狀內皮系統清除，提高藥物利用度，減少藥物劑量，提高藥效、降低不良反應等；③生物相容性良好，易于通過生物屏障(血腦屏障、肺部黏液屏障等)；④抵抗對藥物的耐藥性等[2]。因此，為了提高替加環素的穩定性，改善替加環素的生物利用度，本研究擬制備替加環素脂質體，采用離心法進行包封率測定，并采用響應面法進行制備工藝優化。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 ATX224型電子天平(株式會社島津制作所)；RE-5205型旋轉蒸器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；HH-42型數顯恒溫攪拌循環水箱(常州國華電器有限公司)；PHS-3C型pH計(上海精密科學儀器有限公司)；LC-15C型高效液相色譜儀[島津企業管理(中國)有限公司]；TGL-16G型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；KH-100B型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 替加環素標準品(含量99%，批號：291641，北京百靈威科技有限公司)；大豆卵磷脂(食品級，江蘇源盛通生物工程有限公司)；膽固醇(批號：20181128，國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，上海星可高純溶劑有限公司)；無水乙醇(分析純，上海泰坦科技股份有限公司)；二氯甲烷(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)。

2 方法

2.1 替加環素脂質體的制備 精密稱取10 mg替加環素和適量的膽固醇和大豆磷脂于500 mL圓底燒瓶中，加入二氯甲烷溶解，置旋轉蒸發儀上減壓蒸發制得磷脂膜，加入pH為7.2的PBS緩沖液50 mL，水浴加熱30 min后超聲分散5 min，得到均一的黃色溶液，吸取適量溶液過0.45 μm水系微孔濾膜，得到替加環素脂質體，在4 ℃冰箱中保存[9]。

2.2 脂質體中替加環素含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：UItimate XB-C18(4.5 mm×150 mm，3 μm)，柱溫：室溫25 ℃，流動相：PBS-EDTA緩沖液∶乙腈=75∶25，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：248 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取5 mg替加環素標準品，用“2.2.1”項下流動相配制成0.2 mg·mL-1替加環素儲備液，吸取一定量替加環素儲備液，以流動相作為溶劑梯度稀釋獲得濃度為100、80、40、20、10 μg·mL-1對照品溶液。

2.2.3 線性范圍考察 對照品溶液按“2.2.1”項下的色譜柱條件進行HPLC測定，以峰面積Y為縱坐標，質量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標進行線性回歸，得到方程為Y=50 526X-107 253，R2為0.999，線性范圍為10～100 μg·mL-1。

2.3 建立替加環素脂質體包封率測定方法 將制備好的替加環素脂質體溶液高速離心(15 000 r·min-1、15 min)，取上層清液，過0.22 μm的水系濾膜，用高效液相色譜儀檢測。按如下計算公式計算脂質體包封率(EE)和載藥量，評價替加環素脂質體的質量，另設綜合評分指標直觀評估替加環素脂質體的制備工藝。

包封率(%)=(總替加環素-游離的替加環素)/總替加環素×100%

載藥量(%)=(總替加環素-游離的替加環素)/磷脂用量×100%

綜合評分(%)=包封率×50%+載藥量×50%

3 結果

3.1 單因素試驗 固定二氯甲烷體積和大豆磷脂用量，對替加環素脂質體制備過程中的水化溫度、藥脂比、膽脂比這3個因素進行單因素考察。以高速離心法聯合高效液相色譜法測定替加環素脂質體的包封率。

3.1.1 對水化溫度的考察 固定藥脂比為1∶20，膽脂比為1∶5，設置水化溫度分別是30、40、50、60、70 ℃，按上述方法制備替加環素脂質體并測定其包封率及載藥量，如圖1所示。

圖1 不同水化溫度對替加環素脂質體品質的影響

結果顯示，其他參數條件不變時，70 ℃水化溫度下制備的替加環素脂質體的包封率和載藥量都最高，但在放置4 d后該試驗所得的所有替加環素脂質體受不同水化溫度影響而呈現不同程度的顏色變化，且越高的水化溫度其顏色變化越深。考慮到替加環素在高溫中不穩定易變質，因此棄用70 ℃水化溫度，改用包封率、載藥量次之的60 ℃的水化溫度。

3.1.2 對替加環素和總脂質量比的考察 固定水化溫度為60 ℃，膽脂比為1∶5，設置藥脂比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，按上述方法制備替加環素脂質體并測定其包封率及載藥量，如圖2所示。

圖2 不同藥脂比對替加環素脂質體品質的影響

結果顯示，隨著藥脂比的增大，包封率依次增大，而載藥量依次降低。而在綜合評分上，當藥脂比為1∶30時，數值最大。

3.1.3 對膽固醇和大豆磷脂質量比的考察 固定水化溫度為60 ℃，藥脂比為1∶20，設置膽脂比分別為1∶2、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8，按上述方法制備替加環素脂質體并測定其包封率及載藥量，如圖3所示。

圖3 不同膽脂比對替加環素脂質體品質的影響

結果顯示，當膽脂比是1∶6時，替加環素脂質體的包封率和綜合評分都達到了最高，而載藥量最高的膽脂比則是1∶5。綜合考慮，當膽脂比為1∶6時，制得的替加環素脂質體的品質最優。

3.2 響應曲面法優化處方 根據單因素考查、正交試驗以及Box-Benhnken中心組合試驗設計的原理，確定主要影響制備的因素為水化溫度(A)、藥脂比(B)、膽固醇與大豆磷脂質量比(C)，以替加環素脂質體的包封率、載藥量和綜合評分為響應值，每個因素設 3個水平，進行響應曲面試驗[10]。響應面試驗的因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗的因素與水平設計表

響應面試驗結果見表2。

表2 響應面法試驗結果

3.2.1 以包封率為響應值觀察 利用Design-Expert 軟件進行擬合分析，結果顯示(見表3和圖4)，包封率與A、B、C 呈顯著線性關系(P<0.01)。得到模型的擬合曲線方程為包封率=56.77+2.28×A+9.33×B+9.4×C，即包封率=56.772 94+2.277 5×溫度+9.332 5×藥脂比+9.4×膽脂比。

表3 包封率的響應面方差分析表

模型F值為16.57意味著模型是顯著的?！癙rob>F”值小于0.050 0表示模型項是顯著的。在這種情況下，B、C是重要的模型項。大于0.100 0的值表示模型項不重要。該模型的失擬項P>0.1，不顯著，試驗誤差較小，因此可用此模型對替加環素脂質體制備工藝進行分析和預測。

A.溫度對包封率的影響效果圖；B.藥脂比對包封率的影響效果圖；C.膽脂比對包封率的影響效果圖圖4 單因素對包封率的影響效果圖

替加環素脂質體制備工藝中影響包封率的主次因素順序為C>B>A，即膽脂比的影響最大，藥脂比次之，水化溫度的影響最小。以包封率為指標，最佳處方工藝為A1B1C0，即水化溫度為60 ℃，藥脂比為1∶30，膽脂比為1∶5。

3.2.2 以載藥量為響應值觀察 利用Design-Expert 軟件進行多元回歸擬合分析，結果顯示(見表4和圖5)模型的擬合曲線方程為載藥量=3.56+0.25×A-1.54×B+0.24×C-0.27×A×B+0.098 ×A×C-0.8×B×C-0.31×A2+1.02×B2+0.18×C2，即載藥量=3.556+0.247 5×溫度-1.536 25×藥脂比+0.238 75×膽脂比-0.267 5×溫度×藥脂比+0.097 5×溫度×膽脂比-0.805×藥脂比×膽脂比-0.305 5×溫度2+1.022×藥脂比2+0.177×膽脂比2。

模型F值為32.65意味著模型是顯著的?！癙rob>F”值小于0.050 0表示模型項是顯著的。在本例中，B、BC、B2是重要的模型項。大于0.100 0的值表示模型項不重要。該模型的失擬項不顯著，因此可用此模型對替加環素脂質體制備工藝進行分析和預測。

表4 載藥量的響應面方差分析表

A.溫度與藥脂比對載藥量的影響效果圖；B.溫度與膽脂比對載藥量的影響效果圖；C.膽脂比與藥脂比對載藥量的影響效果圖圖5 不同因素對載藥量的影響效果圖

在溫度與藥脂比的交互作用效果圖中可知，藥脂比的等高線分布較溫度的等高線分度密集，且響應面3D圖形在藥脂比維度上的坡度變化較大。因此認為在替加環素脂質體的制備工藝中，溫度的影響更為顯著，這一結論與表4中的因素顯著性結果一致。

根據載藥量由Design Expert軟件獲得的最佳處方工藝為A1B1C0，即水化溫度為60 ℃，藥脂比為1∶30，膽脂比為1∶5。

3.2.3 以綜合評分為響應值觀察 根據Design-Expert 軟件進行擬合分析，結果顯示(見表5和圖6)，包封率與A，B，C 呈顯著線性關系(P<0.01)。得到模型的擬合曲線方程為綜合評分=30.37+1.26×A+3.9×B+4.82×C，即綜合評分=30.374 71+1.262 5×溫度+3.898 12×藥脂比+4.819 38×膽脂比。各因素影響效果見圖6。

A.溫度對綜合評分的影響效果圖；B.藥脂比對綜合評分的影響效果圖；C.膽脂比對綜合評分的影響效果圖圖6 不同因素對綜合評分的影響效果圖

模型F值為12.16意味著模型是顯著的?！癙rob>F”值小于0.050 0表示模型項是顯著的。在這種情況下，B、C是重要的模型項。大于0.100 0的值表示模型項不重要。該模型的失擬項不顯著[8]，因此可用此模型對替加環素脂質體制備工藝進行分析和預測。

表5 綜合評分的響應面方差分析表

替加環素脂質體制備工藝中影響綜合評分的主次因素順序為C>B>A，即膽脂比的影響最大，藥脂比次之，水化溫度的影響最小。以綜合評分為指標，最佳處方工藝為 A1B1C0，即水化溫度為60 ℃，藥脂比為1∶30，膽脂比為1∶5。

4 討論與結論

制備脂質體過程中，膽固醇作為膜的流動性調節劑，大豆磷脂和膽固醇比例的變化對膜的形成有關鍵影響；成膜后加入水化液在一定溫度下可形成脂質體。包封率和載藥量是評價脂質體制備工藝和質量的重要指標，包封率反映了藥物被載體包封的程度，包封率越高，藥物被利用的程度越高，成本越低；載藥量的大小直接影響到藥物的臨床應用劑量，故載藥量愈大，愈易滿足臨床需要。因此，本實驗以包封率和載藥量為響應值，通過單因素試驗考察了水化溫度、藥脂比、膽脂比等因素對制備工藝的影響，通過響應面試驗優化了脂質體的制備工藝，得到了替加環素脂質體的最優工藝為水化溫度60 ℃、藥脂比為1∶30、膽脂比為1∶5，在此條件下制備的替加環素脂質體的包封率為73.07%，載藥量為3.00%，綜合評分為38.03%。