靶向EGFR治療非小細胞肺癌的小分子研究進展

江筱韻，李夢玲，楊洋，李嘉穎，楊靜雅，許芳

(暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632)

1 概述

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是全球死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]，在我國城市人口惡性腫瘤死亡高居第一位。70%的NSCLC患者在確診時已是晚期，5年平均生存率僅約為15%，惡性程度高，嚴重危害患者生存[2]。其中，肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)是主要的兩種細胞分型。吸煙是誘發NSCLC的主要病因。肺癌生物學發病機制的研究進展對NSCLC的有效治療至關重要。根據患者致病基因的篩查配以相應的治療方法已成為目前個體化治療方案的核心。已發現非小細胞肺癌發生的突變包括表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)，Kirsten rat sarcoma (KRAS)以及anaplastic lymphoma kinase(ALK)等。其中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)突變，EGFR調控細胞的增殖、分化及凋亡。通過抑制其酪氨酸激酶的活性表達，可以有效抑制腫瘤的生長和增殖[3-4]。筆者主要總結了非小細胞肺癌發生發展的病理學機制以及靶向EGFR治療NSCLC的小分子研究進展。

1.1 EGFR及其相關耐藥性突變 EGFR是一種受體型酪氨酸激酶，由胞外區(N末端)、單次跨膜區和胞內區(C末端)組成。EGFR胞內區的酪氨酸激酶域有ATP結合位點，能催化C末端氨基酸殘基以實現自身磷酸化。作用于EGFR的配體主要有：表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、轉化生長因子α(transforming growth factor α,TGFα)和調節素(amphiregulin,AR)。EGFR與配體結合后發生同源或異源二聚，進一步引起自身磷酸化，磷酸化的EGFR可調控下游蛋白從而啟動不同的信號轉導通路。EGFR主要調控的信號通路有：Ras/Raf/MAPK、PI3K/Akt和JAK/STAT。將信號由胞質傳遞到胞核，分別調控細胞增殖，分化及凋亡等一系列生理過程。EGFR基因家族表達于正常人體上皮組織中，如皮膚、毛囊、胃腸道壁等，對細胞生長，分化，組織更新和傷口愈合起重要作用[5-6]。

國內外先后開發了多個EGFR抑制劑用于臨床。一代EGFR抑制劑，代表藥物包括：阿斯利康公司(AstraZeneca)推出的吉非替尼(易瑞沙，Iressa)和羅氏制藥(Roche)的厄洛替尼(特羅凱，Tarceva)[7-8]。NSCLC患者用藥后緩解率、生活質量和無進展生存期均明顯改善。然而，患者在連續藥物10-12個月后，大部分產生了耐藥性[9]。二代EGFR抑制劑如勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim)的阿法替尼(Afatinib)、輝瑞公司(Pfizer)的達克替尼(Dacomtinib)和惠氏制藥(Wyeth)開發的來那替尼(Neratinib)等[10-11]。上述藥物由于選擇性差，藥物毒副作用(嚴重皮疹和腹瀉)呈劑量依賴性，以及體內和臨床試驗中產生EGFR的 T790M位點突變誘發耐藥等問題而逐漸退出臨床[12-13]。第三代抑制劑是EGFR T790M選擇性非可逆抑制劑，以阿斯利康(AstraZeneca)公司開發的奧希替尼(泰瑞莎，Osimertinib，AZD9291或TAGRISSOTM)，克洛維斯腫瘤公司(Clovis Oncology)的Rociletinib(CO-1686,AVL-301)，勃林格殷格翰公司的Olmutinib(HM61713)，諾華制藥公司(Novartis)的Nazartinib(EGF816)和安斯泰公司(Astellas)的ASP8273等為代表性藥物[13-14]，具體見圖1。上述藥物適用于治療晚期NSCLC患者，特別是攜帶EGFR常見突變Del19和L858R，以及T790M突變的患者。其中，Osimertinib和Rociletinib對EGFR T790M相對于EGFR WT型的選擇性分別為40倍和14倍。上述兩種藥物分別于2013年和2014年獲得美國FDA孤兒藥認證，并相繼獲得了美國FDA“突破性治療藥物資格”。然而用藥一段時間后，NSCLC患者相繼出現新復發耐藥，其主要原因與EGFR發生了新的耐藥突變有關[15-16]。當前國內外圍繞克服Osimertinib(Osi)為代表的三代抑制劑耐藥做了大量研究工作，本文主要總結和歸納了近年來NSCLC領域Osimertinib介導的EGFR主要耐藥性突變，以及為克服Osimertinib而開發的小分子(抑制劑和降解劑)。以期為開發克服EGFR突變耐藥的NSCLC藥物提供研究基礎。

2 EGFR突變介導Osimertinib耐藥機制

鑒于NSCLC存在靶點多種突變型特征，其治療已進入分型治療階段，即：根據不同的分子特征來選擇相應的分子靶向藥物進行治療，可有效提高患者的中位生存時間。EGFR小分子抑制劑是治療NSCLC患者的有效策略，然而治療后患者往往會出現耐藥，如何解決耐藥，是當前臨床亟待克服的世界難題。引起EGFR抑制劑耐藥的主要原因是EGFR20號外顯子出現T790M點突變，臨床上該位點突變的NSCLC患者超過50%。三代抑制劑為克服這一突變而誕生。

圖1 已獲批上市的三代EGFR抑制劑藥物

典型代表性藥物是Osimertinib又名Tagrisso或AZD9291，中文名：奧西替尼(泰瑞沙)(見圖1)。可用于治療EGFR T790M突變陽性的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌，療效顯著，且副作用較低。2013年獲得美國FDA孤兒藥認證，并獲得了美國FDA“突破性治療藥物資格”。由于可通過血腦屏障，對腦轉移也顯示有一定療效。2015年11月13日經FDA加速批準上市，是首個獲批上市用于經EGFR-TKI治療失敗后病情進展的T790M突變陽性NSCLC靶向藥物。2018年4月，美國FDA進一步批準了Osimertinib作為治療攜帶EGFR L858R、EGFR del E746-A750等激活性突變的轉移性NSCLC的一線藥物，大大擴展了其臨床使用范圍。值得關注的是，奧希替尼與EGFR不可逆結合，不僅可以克服由于一二代EGFR-TKI耐藥的EGFR T790M突變，同樣可用于治療EGFR敏感突變(19Del和21L858R)的晚期NSCLC患者[17]。圍繞奧希替尼開展的系列臨床多中心開放性Ⅰ/Ⅱ期研究工作(簡稱AURA)將I期和拓展性研究包括起來，得出更重要的結論。

AURA[18-20]系列臨床研究中，奧希替尼最常見的不良事件包括皮疹、腹瀉、皮膚干燥和甲溝炎等。此外相比其他一二代EGFR-TKI，奧希替尼3級及以上不良事件發生率較低(32% vs 41%)。一項奧希替尼AURA ex和AURA2[19]的日本人群的合并分析顯示，ILD(interstitial lung disease,間質性肺疾病)的發病率約為6.2%，提示日本人群的ILD發病率拉高整體人群的ILD發病率。而在FLAURA[21]和AURA的系列研究中，共納入284名中國患者，其ILD的發生率為1.4%，因為ILD導致死亡的比例為0%。

然而，隨著EGFR三代抑制劑Osimertinib的廣泛應用，EGFR T790M獲得性耐藥突將臨床治療NSCLC帶入新困境[22]。Osimertinib的耐藥機制復雜，主要包括：①EGFR發生Cys797Ser797突變(EGFRC797S)，使得藥物無法與蛋白形成共價非可逆結合，降低藥物與ATP的競爭活性；②非小細胞肺癌向小細胞肺癌轉化；③促癌基因，如MET、k-Ras、ErbB-2、EphA2、FGFR、TAM受體成員Mer和Axl、NF-κB、B-Raf和PIK3CA等，發生突變和增強[23]。其耐藥機制主要可分為EGFR依賴型和EGFR非依賴型(見圖2)。

圖2 EGFR突變型NSCLC潛在治療策略及耐藥機制示意圖

2.1 EGFR依賴型耐藥機制 靶向治療策略的常見耐藥機制之一為靶點的獲得性突變。在部分奧希替尼用藥的NSCLC患者中。后續發生EGFR C797S突變阻斷了奧希替尼與靶點EGFR C797位點的有效結合[24]，從而使得Osi失效。此外，也在Osi耐藥的患者中發現發現EGFR G796D、G796S/R、L792F/Y/H、C797G、L718Q等繼發性EGFR突變現象[25]。此外在Osi耐藥患者中也發現EGFR 外顯子19和野生型顯著增強，以及EGFR T790M缺失的現象。以及EGFR受體蛋白總體表達下降。然而有趣的是，EGFR生長因子在Osi耐藥后病情發生惡性進展的NSCLC患者中表達水平持續升高。這些現象反映了Osi耐藥機制的復雜性。

2.2 EGFR非依賴型耐藥機制 已知許多受體酪氨酸激酶和EGFR具有相似的下游調節途徑，從而激活腫瘤惡性進展[17]。NSCLC細胞內，可通過旁路激活的方式調節其他激酶活性，從而激活EGFR下游信號通路，“逃逸”Osi對EGFR下游信號的抑制，促進細胞存活。這一旁路激活方式包括了一系列非EGFR激酶的突變性激活，增強或缺失。如BRAF V600E、PIK3C E545K、PTEN Y27C、CTNNB1 S37F和TSC2 N486I突變；KRAS G12S突變，NRAS E63K和Q61K突變。Src家族激酶激活，YES1增強以及MAPK1、AKT3和AXL異常過表達。PTEN缺失的現象也在部分Osi耐藥患者中發現。

此外，一些疾病表型的變化也在部分Osi耐藥患者中觀察到。如部分Osi耐藥患者表現為非小細胞癌向小細胞癌(SCLC)的組織學轉化和上皮間質轉化(EMT)，這也表明了Osi耐藥機制的復雜性。

3 第四代EGFR小分子抑制劑

3.1 EAI045 EAI045(見圖3)是一種變構抑制劑，它靶向選擇產生耐藥的EGFR突變體，但不作用于野生型EGFR受體。對EAI045的細胞活性的初步研究表明，它在L1975R/T790M突變型NSCLC細胞系H1975細胞、用L858R/T790M突變體穩定轉染的NIH-3T3細胞中能有效降低EGFR自磷酸化，但不能完全消除。進一步研究發現，對一組EGFR突變的Ba/F3細胞，EAI045能抑制L858R/T790M和L858R突變細胞的增殖，但不抑制exon19del/T790M或親代Ba/F3細胞的增殖，這表明其對靶標的突變體具有選擇性。后續研究表明，EAI045與西妥昔單抗聯合用藥在發生EGFR(L858R/T790M)和EGFR(L858R/T790M/C797S)驅動突變的肺癌小鼠試驗中證明有效[26]。

3.2 JBJ-04-125-02 To等[27]研究發現，JBJ-04-125-02(見圖3)在EGFR C797S模型中在體內和體外均可作為單一藥物有效。JBJ-04-125-02能抑制用EGFR L858R，L858R/T790M或L858R/T790M/C797S突變穩定轉染的Ba/F3細胞系中細胞的增殖能力，而不抑制親代Ba/F3或野生型EGFR Ba/F3細胞的生長，其抑制上述3種突變的IC50分別為1.0 nmol·L-1、0.4～0.5 nmol·L-1、0.0～0.1 nmol·L-1。值得注意的是，JBJ-04-125-02是唯一可以抑制細胞增殖的單一藥物化合物，其聯合西妥昔單抗使用時，相比于EAI045也是最有效的。繼而進行的體內藥效學研究表明，在EGFR L858R/T790M/C797S基因工程小鼠體內，JBJ-04-125-02治療在治療4周內導致明顯的腫瘤消退。

3.3 2,9-二取代8-苯硫基-9H-嘌呤化合物 Hei等[28]合成了31個包含2,9-二取代8-苯硫基/苯亞磺酰基-9H-嘌呤支架的新型EGFR抑制劑，并進行了生物學評估。其中，化合物C9(圖3)對HCC827細胞株的IC50為29.4 nmol·L-1，對EGFR L858R的IC50為1.9 nmol·L-1。化合物C12對EGFR L858R/T790M/C797S表現出中等抑制活性(IC50=114 nmol·L-1)。Western blot分析表明，C9可以顯著抑制EGFR磷酸化。其后進行體內測試發現，化合物C9在已建立的裸鼠HCC827移植瘤模型中，口服給藥5.0 mg·kg-1能明顯抑制腫瘤生長。這些結果表明2,9-二取代8-苯硫基/苯基亞磺酰基-9H-嘌呤化合物可以作為有效的EGFR(L858R)抑制劑和抗癌藥。此外，優化化合物C12可能可以發現新的第四代EGFR-TKI。

3.4 4-氨基吡唑嘧啶類化合物 Engel等[29]設計了一類4-氨基吡唑并嘧啶的核心結構的化合物，作為新型EGFR T790M突變抑制劑，合成了1a～1c 3個化合物(見圖3)。整個系列的化合物對H1975細胞(GI50值分別為0.21、0.49和0.14 μmol·L-1，分別對應1a、1b和1c)有良好的抑制作用，同時對EGFR野生型(WT)細胞(A431；26～49倍)的抑制作用降低。進一步研究發現，1c對獲得性耐藥性L858R/T790M/C797S有中等抑制作用(IC50為88 nmol·L-1)，其親和力約是1a、1b的20倍。這一結果提示4-氨基吡唑嘧啶類化合物可能刺激針對獲得性T790M和C797S耐藥的第四代EGFR抑制劑的發展。

圖3 第四代EGFR抑制劑(上)

3.5 三取代咪唑類化合物 Günther等[30]基于高效可逆p38抑制劑的設計出了三取代咪唑類化合物，該類化合物能夠有效抑制EGFR L858R/T790M/C797S三重突變體。生物實驗表明，化合物9(見圖4)在雙突變EGFR L858R/T790M酶測定中，IC50值為18 nmol·L-1。化合物19a(見圖4)是一種高效的EGFR抑制劑，針對EGFR-L858R/T790M測定的細胞比野生型具有約300倍高的選擇性，且對所有三種激酶變異體顯示IC50值低于1 nmol·L-1。在此基礎上設計合成的共價化合物31a以及可逆對應物31b(見圖4)，在1 nmol·L-1以下的生化環境中表現出對EGFR-L858R/T790M/C797S三重突變體強烈的抑制作用。這些研究表明了三取代咪唑類化合物有希望作為三代后的新一代EGFR抑制劑克服三重突變的可能性。

3.6 吡咯嘧啶類化合物 Lategahn等[31]設計了基于吡咯嘧啶支架的耐藥守門突變體EGFR-L858R/T790M的共價抑制劑。該研究顯示N型烷基化吡咯嘧啶類化合物29a-l和O型烷基化吡咯嘧啶類化合物19a～h有較高的抗EGFR活性，其中化合物19g和19h(見圖4)的活性最高，IC50值均約為9 nmol·L-1。與前三代EGFR-TKIs相比，這兩類化合物具有更好的生化效力。因此，吡咯嘧啶類化合物可作為新一代EGFR抑制劑的研究方向。

4 新興EGFR小分子降解劑

分子靶向藥物出現耐藥幾乎是無法避免的，有些新的突變位點可能會難以靶向而造成新一代藥物研究開發困難。近年來，新興的蛋白水解靶向嵌合體(proteolysis-targeting chimeras,PROTACs)技術能精準降解靶蛋白，使以往“難以靶向”的靶點的藥物研發成為可能，是一種全新的抗癌策略。PROTAC(靶向蛋白降解技術)是一種雙功能小分子，其一端是結合靶蛋白(protein of interest,POI)的配體，另一端是結合E3泛素連接酶的配體，二者之間通過一段linker連接。這個三元復合物形成后，在體內可以將靶蛋白和E3酶拉近，使靶蛋白被打上泛素標簽，最后通過泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin proteasome system,UPS)降解[32]。在蛋白質被降解后，PROTAC分子可以被釋放并且進入下一個降解過程(見圖5)[33]。

圖4 第四代EGFR抑制劑(下)

圖5 proteolysis targeting chimera(PROTAC)技術

迄今為止，盡管在人體內發現的E3連接酶有600多種，但已報道的可以用于PROTAC的相關E3泛素連接酶只有少數的幾種，如：CRBN(cereblon)、VHL(vonhippel-lindau)、MDM2(mouse double minute 2)、IAPs(inhibitor of apoptosis proteins)等[34]。

4.1 EGFR PROTAC研究進展 在治療非小細胞肺癌(NSCLC)的過程中，第一代和第二代的EGFR抑制劑出現了耐藥性，第三代奧希替尼等EGFR抑制劑雖然克服了第一代和第二代EGFR抑制劑的耐藥問題，但是干擾EGFR不可逆抑制劑與EGFR之間的共價結合[35-36]。因此，開發EGFR降解劑正面臨著挑戰。

幸運的是，2018年Crews團隊首次證明了PROTACs能夠降解受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs)，并且報道了一種以EGFR抑制劑Afatinib為EGFRL858R/T790M蛋白親和配體，以VHL為E3連接酶配體的雙分子靶向蛋白降解劑(PROTAC3，見圖6)[37]。同時，他們還提供了基于相應抑制劑的3種RTKs(EGFR、 HER2、 c-Met)的PROTAC成功降解實例，其中包括EGFR和c-Met的多個突變體。這個研究極大地擴展了跨膜蛋白可以作為PROTACs的潛在靶點，并提出了EGFR-PROTACs可以作為克服C797S介導的耐藥性的潛在策略的新想法。最近，國內Jin Jian課題組以Gefinitib為頭部分子設計并得到了MS39和MS154兩個EGFR降解劑小分子，通過實驗證明這兩個小分子能有效降低EGFR突變體的蛋白水平并抑制肺癌細胞中的下游信號傳導[38]；張三奇團隊設計并證明了一個2,4,6-三取代嘧啶[3,4-d]嘧啶衍生物可以作為EGFRDel19的降解物。其中，PROTACs2和10能夠誘導HCC827中的EGFR降解，(DC50值分別為34.8和45.2 nmol·L-3)，且降解劑2和10可顯著誘導HCC827細胞凋亡，并在G1期阻滯細胞(見圖6)。這些發現表明，在HCC827細胞中EGFEDel19可以被所設計的降解劑有效地靶向降解[39]。同年，丁克團隊在XTF-262的基礎上設計合成了一個化合物14O可有效和選擇性地降解EGFRL858R/T790M(DC50值為5.9 nmol·L-3)，且對野生型蛋白質無影響，他們使用的E3泛素連接酶部分是VHL配體(見圖6)。進一步的研究機理表明，降解過程是通過泛素-蛋白酶體途徑介導的，因此，化合物14O可作為新的EGFRL858R/T790M降解劑的起始先導分子[40]。

圖6 EGFR小分子降解劑

5 總結與展望

靶向小分子發生耐藥是臨床NSCLC治療難題，奧希替尼能有效克服EGFR T790M突變耐藥在臨床引起廣泛關注。然而，隨著EGFR三代抑制劑Osimertinib的廣泛應用，EGFR T790M獲得性耐藥突變將臨床治療NSCLC帶入新困境[22]。Osimertinib的耐藥機制復雜，既有EGFR依賴的，也有EGFR非依賴的機制。主要包括：①EGFR發生Cys797 Ser797突變(EGFR C797S)，使得藥物無法與蛋白形成共價非可逆結合，降低藥物與ATP的競爭活性；②非小細胞肺癌向小細胞肺癌轉化；③促癌基因，如MET、k-Ras、ErbB-2、EphA2、FGFR、TAM受體成員Mer和Axl、NF-κB、B-Raf和PIK3CA等，發生突變和增強。盡管應對Osimertinib耐藥的第四代EGFR抑制劑相繼開發，也取得了一定療效。但針對靶點開展的小分子占位驅動型研發不可避免地會帶來靶點突變而耐藥。新興PROTAC技術為事件驅動型療法，以清除致病靶蛋白為目標，而對其他蛋白不降解。EGFR T790M小分子降解劑只降解腫瘤組織中的EGFR T790M突變型蛋白，而對正常組織中的EGFR不降解。這在很大程度上避免了副作用。近年來，PROTAC技術發展迅速，利用PROTAC技術治療EGFR突變的非小細胞肺癌的研究也正在進行當中，雖然在其發展過程中面臨E3酶配體較少等問題，但這項技術仍為克服Osimertinib耐藥提供了重要解決方案。