EGFL6在胃癌血管生成中的作用

門 慧，談 順

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤，轉移是胃癌患者死亡的重要原因。探討胃癌發生、發展相關的分子機制從而尋求有效的治療手段是現階段研究的重要任務[1-2]。腫瘤微環境是腫瘤細胞賴以生存的土壤，腫瘤侵襲、轉移需要新生血管支持，而血管內皮細胞是血管形成的基礎[3]。EGFL6屬于EGF重復超級家族，是一種分泌蛋白，特征是EGF結構域重復，由于同時具有EGF結構域和MAM結構域，又被命名為MAEG，參與細胞周期、增殖及發育調節[4]。文獻報道，EGFL6在多種腫瘤中表達上調，并促進腫瘤血管形成：如EGFL6促進乳腺癌侵襲、轉移及血管形成[5]；EGFL6能促進卵巢癌[6]、結直腸癌[7-9]侵襲、轉移；EGFL6在黑色素瘤[10-11]、鼻咽癌[12]、口腔鱗狀細胞癌[13]、肺腺癌[14]中高表達；EGFL6促進斑馬魚胚胎血管形成[15]。迄今為止，EGFL6在胃癌微環境中的生物學作用尚未見報道。本文著重探討EGFL6在胃癌血管生成中的作用，為臨床腫瘤治療提供新的分子治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器細胞株、胃癌組織均來自中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院，RPMI 1640培養基、胎牛血清購自BI生物公司，0.25%胰酶購自Life公司，EGFL6多克隆抗體購自Abcam公司，CD34抗體購自福州邁新公司，過表達質粒購自廣州銳博公司，慢病毒上清自提，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及蛋白濃度測定試劑盒購自Bioword公司，5×SDS蛋白上樣緩沖液、ECL化學發光液、全蛋白提取試劑盒購自凱基生物公司，電泳儀購自BAYGENE公司，低溫高速離心機購自Thermo公司，蛋白濃度的酶標儀購自BIO-BRAD公司，分光光度計及低溫離心機購自Thermo公司。Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑購自TaKaRa公司，β-actin單克隆抗體購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 胃癌細胞株及人類血管內皮細胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培養基置于37 ℃ 5%CO2培養箱中培養，選擇狀態佳的細胞株用于實驗。

1.2.2EGFL6過表達穩定株構建 提前48 h鋪工具細胞293T于75 cm2培養瓶中，至細胞融合度達70%左右，細胞液換成無血清RPMI 1640培養基，取2.5 μg EGFL6質粒、5 μL HIV包裝質粒混合液于1.5 mL無菌EP管，加入Opti-Mem液至200 μL；加入15 μL EndoFection轉染試劑于1.5 mL無菌EP管，加入Opti-Mem至200 μL，將本次200 μL混合液加入前一支1.5 mL EP管，混勻，靜置20 min。然后再把混合液加入293T細胞中，再加入1/500總體積的Titerboost增強劑。細胞培養箱內培養12 h，用含5%胎牛血清RPMI 1640培養基換液(內含有雙抗1 ∶100比例配置)，繼續培養48 h，取病毒上清，離心、過濾，-80 ℃保存。前一天鋪MGC803細胞于6孔板中，至細胞融合度約70%，用已收集好的病毒上清換液，每孔1 mL，繼續培養36 h，用含5%胎牛血清RPMI 1640培養基換液(內含有雙抗1 ∶100比例配置)，培養至細胞長滿，用含有嘌呤霉素的培養基藥篩，最后擴大培養。

1.2.3RT-PCR (1)細胞及組織總RNA提取：細胞生長鋪滿瓶底，PBS洗3次，每10 cm2瓶壁面積加入1 mL Trizol試劑，于冰上裂解5 min，0.2 mL氯仿/1 mL Trizol比例加入氯仿，混勻冰上置2～3 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上層水相轉移至去酶1.5 mL離心管，沉淀RNA中加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，除上清，收沉淀，DEPC處理過的水配制75%乙醇洗滌，離心，室溫放置自然干燥，DEPC水溶解RNA，測RNA濃度。組織總RNA提取：研缽洗凈置180 ℃烤箱烘烤5 h，冷卻備用，研缽中加入適量的液氮，將組織剪約綠豆大小研磨成粉末狀，加入Trizol 1 mL勻漿裂解，裂解物移至DEPC水處理過的1.5 mL微離心管中，余步驟同前。(2)逆轉錄反應：按TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書加入相應試劑配制反應體系，37 ℃反應15 min，85 ℃滅活5 min，反轉錄產物用DEPC水稀釋約4倍，-20 ℃保存，備用。(3)RT-PCR反應：EGFL6引物序列：上游5′-AG GCATCACGGGTTGTTAGC-3′；下游5′-CGTAGCAG CAGGCCAGTTTAG-3′，根據TaKaRa RT-PCR試劑盒說明書配制反應體系，95 ℃預變性10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃約30 s、72 ℃ 34 s，合計40個循環。7500 Fast Real-time PCR儀取得各模板Ct值，以Folds=2-ΔΔCt代表實驗組及對照組目的基因表達關系。

1.2.4Western blot法 (1)蛋白濃度測定-BCA法：采用Bioworld公司BCA Protein Assay Reagengt Kit進行檢測。酶標儀器測量570 nm處吸光度值(OD值)，測量蛋白濃度。(2)Western blot：配制10%SDS-PAGE分離膠、5%SDS-PAGE濃縮膠，每個泳道上樣量40 μg，進行電泳。根據蛋白Marker位置切目的條帶，Bio-Rad微型電轉系統，200 mA電流，冰上轉膜，條帶封閉(含約5%脫脂奶粉或血清的PBST)1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜。PBST洗膜，加入HRP標記抗兔二抗，室溫孵育約1 h，PBST洗膜。于化學發光儀中進行發光。

1.2.5條件培養基的制備 胃癌細胞株置于75 cm2的培養瓶，長滿至瓶底面積80%～90%，PBS洗2次，改用無血清RPMI 1640培養基繼續培養24 h，吸取細胞培養液至無菌離心管，離心、棄沉淀，取上清，置于-80 ℃中保存備用。

1.2.6雞胚尿囊膜實驗 取6～7日齡的雞胚，在超凈臺內用有齒小鑷鈍頭在氣室中心敲開一個直徑約1 cm小洞，將直徑約0.8 cm無菌的橡膠圈放入已暴露好的雞胚尿囊膜表面，條件培養基約200 μL加入橡膠圈中，醫用膠白布封口，置于37 ℃、80%濕度的孵箱內孵育48～72 h。取出處理好的雞胚，將丙酮與甲醇混合液(1 ∶1比例配置)滴入尿囊膜表面，固定15 min，尿囊膜輕輕剪下來，生理鹽水浸泡，撈片、攤片，拍照。

1.2.7小管形成實驗 人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC饑餓過夜，將Matrigel基質膠鋪于24孔板，每孔200 μL，37 ℃細胞培養箱30 min，每孔鋪2×104個HUVEC細胞于基質膠上并加入200 μL條件培養基，于37 ℃ 5%CO2細胞培養箱孵育12 h，鏡下觀察小管形成情況。

1.2.8Transwell遷移實驗 人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC饑餓過夜，將600～800 μL條件培養基加入24孔板下室中，上室加約200 μL細胞懸液，每個小室加入2×105個細胞，置37 ℃ 5%CO2培養箱培養約12 h。取出小室，用PBS液沖洗小室3次，經10%中性福爾馬林固定，蘇木精染色。顯微鏡下觀察穿過膜的細胞數，取上、下、左、右、中5個視野，計數穿過膜細胞數。

1.2.9免疫組化 采用免疫組化SP法染色。具體步驟：烤片、脫蠟、抗原修復、阻斷滅活內源性過氧化物酶、山羊血清工作液封閉、一抗4 ℃冰箱孵育過夜、生物素標記二抗、辣根過氧化物酶孵育、DAB顯色、蘇木精染色、脫水、透明、干燥、封固定。判斷標準[16]：(1)按細胞著色強度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞所占百分比計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩項得分結果相加：3～4分為低表達，5～7分為高表達。微血管密度(microvessel density, MVD)計數[16-18]：取3個腫瘤血管密度最高的熱點區(100×)，在這3個熱點區隨機計數5個視野微血管數目(200×)，取5個視野微血管數目均值為本例的MVD(微血管是指管腔直徑約>8個紅細胞直徑的總和)。

1.3 統計學分析采用Graphpad Prism統計軟件進行統計學分析，兩組均數間比較采用配對樣本t檢驗，生存率的比較采用Mantel-Cox檢驗，取α=0.05為檢驗標準。

2 結果

2.1 胃癌組織中EGFL6 mRNA的表達RT-PCR技術檢測40例配對新鮮胃癌組織中EGFL6 mRNA表達，與周圍正常胃黏膜組織比較，胃癌組織中EGFL6 mRNA高表達31例，低表達9例。結果顯示與周圍正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中EGFL6 mRNA表達水平明顯上調(P<0.05，圖1)。

圖1 RT-PCR技術檢測40例新鮮配對胃癌組織中EGFL6 mRNA的表達水平：

2.2 EGFL6表達與胃癌患者預后的相關性利用Kaplan-Meier生存曲線分析EGFL6表達與胃癌患者5年生存時間的關系，31例高表達組患者的中位生存時間為36個月，9例低表達組患者的中位生存時間為48個月。EGFL6高表達患者5年生存率明顯低于EGFL6低表達患者(P<0.05，圖2)。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析EGFL6表達與胃癌患者5年生存率的關系

2.3 胃癌組織中EGFL6的表達與腫瘤MVD計數的關系免疫組化結果顯示，在胃癌組織中EGFL6高表達39例，低表達11例，高表達組MVD計數平均為(36.46±0.71)個/HPF，低表達組MVD計數平均為(16.64±0.92)個/HPF(圖3A～D)；EGFL6高表達組的MVD計數明顯高于低表達組(P<0.05，圖3E)。

圖3 A.EGFL6在胃癌組織中高表達；B.EGFL6高表達胃癌組織中的MVD;C.EGFL6在胃癌組織中低表達;D.EGFL6低表達胃癌組織中的MVD;E.EGFL6高表達組與低表達組MVD計數統計圖

2.4 Western blot法及RT-PCR技術檢測胃癌細胞株中EGFL6內源性表達Western blot法及RT-PCR檢測3株胃癌細胞株AGS、BGC823、MGC803中EGFL6的表達水平，結果顯示EGFL6在MGC803細胞中表達水平最低(圖4)。

圖4 A.Western blot法檢測3株胃癌細胞株中EGFL6蛋白表達；B.RT-PCR技術檢測3株胃癌細胞株中EGFL6 mRNA表達

2.5 Western blot法及RT-PCR技術檢測慢病毒感染效率Western blot法及RT-PCR技術檢測EGFL6慢病毒過表達載體感染MGC803細胞后EGFL6水平，結果顯示：MGC803/MOCK組及MGC803/EGFL6組帶有綠色熒光的病毒載體成功轉入胃癌細胞株中(圖5A)；與MGC803/MOCK組相比，MGC803/EGFL6組EGFL6的蛋白及mRNA水平均明顯上調(圖5B、C)，兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

圖5 A.熒光顯微鏡檢測目的病毒載體成功轉入胃癌細胞株中;B.Western blot法檢測MGC803/EGFL6穩定細胞株構建效率;C.RT-PCR技術檢測MGC803/EGFL6穩定細胞株構建效率

2.6 Western blot法檢測條件培養基中EGFL6蛋白表達Western blot法檢測結果顯示，與MGC803/MOCK組相比，MGC803/EGFL6組蛋白表達水平明顯上調(圖6)。

圖6 Western blot法檢測條件培養基中EGFL6蛋白表達

2.7 血管形成實驗雞胚尿囊膜實驗、小管形成實驗及內皮細胞遷移實驗觀察EGFL6促進體內、外血管形成情況，與MGC803/MOCK組相比，MGC803/EGFL6組體內、外血管形成能力明顯增加(圖7)，兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)；提示EGFL6能夠促進體內、外血管形成能力。

圖7 A.雞胚尿囊膜實驗觀察體內血管形成能力;B.小管形成實驗觀察體外血管形成能力;C.內皮細胞遷移實驗觀察體外血管形成能力;D.內皮細胞穿過小室膜數量統計圖

3 討論

胃癌是全球發病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一。由于其復發率及轉移率均較高，患者預后較差。腫瘤侵襲、轉移是一個多因素、多階段復雜的病理過程，需要多種基因相互調控協助工作，腫瘤細胞轉移需要新生血管的形成，為其提供各種細胞因子及營養成分。生理情況下，機體僅在需要時才會有新生血管形成，而在腫瘤發生、發展時這種平衡狀態

會被打破，最終使得腫瘤內血管不斷形成。目前胃癌的治療在手術、放化療等方面取得了較大進展，但生存率結果依然不容樂觀，而抗腫瘤血管生成治療在胃癌治療中起重要作用[19-23]。

EGFL6蛋白是EGF重復超級家族中的一員，其特征是EGF結構域重復，由于同時具有EGF結構域和MAM結構域，又被命名為MAEG，參與細胞周期、增殖及發育調節，由于包括了1個N端信號肽，所以是一種分泌蛋白。EGFL6與乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、結直腸癌、鼻咽癌等腫瘤均密切相關，EGFL6促進乳腺癌侵襲、轉移及血管形成，EGFL6通過p-ERK促進骨微環境血管生成從而促進骨質愈合[24]，EGFL6促進斑馬魚胚胎血管形成，同家族成員EGFL7可以促進胰腺癌細胞侵襲、轉移及血管形成，促進神經膠質瘤及腎細胞癌血管形成[25-27]，EGFL6在胃癌微環境中的作用至今尚未見文獻報道。

本實驗通過RT-PCR技術檢測發現胃癌組織中的EGFL6 mRNA表達水平上調，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，EGFL6表達與胃癌患者5年生存率呈負相關。采用免疫組化法檢測胃癌組織中EGFL6蛋白表達，并利用CD34計數MVD，結果顯示高表達EGFL6組MVD計數明顯增多，說明EGFL6有促進胃癌組織血管形成的趨勢。為了驗證這一現象，本實驗采用血管形成實驗進一步分析，選取內源性表達較低的胃癌細胞株MGC803進行EGFL6慢病毒過表達細胞株構建，RT-PCR及Western blot法檢測結果顯示，過表達細胞株構建成功。收集過表達MGC803/EGFL6胃癌細胞株條件培養基，Western blot法檢測結果顯示，條件培養基制備成功。利用血管形成實驗(雞胚尿囊膜實驗、小管形成實驗及內皮細胞遷移實驗)檢測胃癌組織中血管生成情況，結果顯示EGFL6促進胃癌血管形成。

本實驗結果表明，EFGL6在胃癌中高表達，與患者預后呈負相關，并能促進胃癌血管形成，但EGFL6在胃癌組織中促進血管形成具體作用機制及信號通路仍不清楚，有待后續實驗深入探究。EGFL6有望成為腫瘤標志物的篩查指標，為臨床腫瘤診治及新藥研究提供新的靶點依據，更好的服務于患者。