新疆地區(qū)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白的原核表達(dá)

蘇 燕，蘇 艷

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830052）

產(chǎn)氣莢膜梭菌是主要分布于人畜糞便及腸道中的一類厭氧的條件性致病菌，最早稱為魏氏梭菌，該菌在分解動(dòng)物組織的糖分時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量氣體，且絕大部分菌株在生長過程中都有莢膜形成，因而稱之為產(chǎn)氣莢膜梭菌[1]。產(chǎn)氣莢膜梭菌在世界各地都有存在，給全球養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了嚴(yán)重影響[2]。其致病性主要來源于產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的毒素，不同毒素的致病機(jī)制不同，在眾多外毒素中α、β、ε和ι是最主要的[3]，這4種外毒素會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用，威脅著人和動(dòng)物的健康[4,5]。現(xiàn)階段將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E、F、G7個(gè)細(xì)菌型[6]，其中A型和C型對(duì)人的致病性極強(qiáng)[7]。所有的產(chǎn)氣莢膜梭菌都分泌α毒素，A型菌分泌的α毒素量最大[8]。研究新疆地區(qū)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白對(duì)該區(qū)域產(chǎn)氣莢膜梭菌病的流行以及防治具有指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

質(zhì)粒pET-30a載體（實(shí)驗(yàn)室保存），商品化的感受態(tài)，質(zhì)粒和基因組提取試劑盒、快切酶、T4快速連接酶，過硫酸銨、丙烯酰胺、青霉素、還原性谷胱甘肽、誘導(dǎo)劑（IPTG）、低溫離心機(jī)等。

1.2 設(shè)計(jì)引物

在NCBI網(wǎng)址中下載編碼α毒素基因序列，并去掉信號(hào)肽片段，該基因共計(jì)927 bp，設(shè)計(jì)α毒素基因的引物，將設(shè)計(jì)好的基因引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成，引物序列如表1所示，引物稀釋后凍存。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因引物序列

1.3 擴(kuò)增α毒素基因

用培養(yǎng)24 h后的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌提取基因組，并以此為模板，用1.2合成的引物PCR擴(kuò)增α毒素基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物加至1.2%瓊脂糖凝膠孔中，待電泳結(jié)束后回收α毒素基因片段。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用快切酶EcolⅠ和SalⅠ雙酶切α毒素基因與pET-30a載體，于37℃水浴鍋中酶切20 min后回收酶切產(chǎn)物，酶切后的α毒素基因和pET-30a載體用連接酶過夜連接，次日轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，將感受態(tài)復(fù)蘇后用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，之后選單菌落在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，并以菌液為模板PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，隨后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并送至公司測(cè)序。

1.5 α毒素蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中過夜培養(yǎng)，次日擴(kuò)大培養(yǎng)后保存菌液。選取9個(gè)高壓滅菌過的搖菌瓶，每個(gè)加入200 ml含有抗生素的培養(yǎng)基和2 ml的菌液培養(yǎng)，待菌液OD600值達(dá)到0.4～0.8時(shí)，將誘導(dǎo)試驗(yàn)分為3組，第一組為16℃過夜誘導(dǎo)，第二組為28℃過夜誘導(dǎo)，第三組為37℃誘導(dǎo)5 h。每組設(shè)置IPTG的濃度分別為0.25 mmol/L、0.5 mmol/L和1 mmol/L。收集誘導(dǎo)后的菌液至離心瓶中，低溫重復(fù)離心清洗黏附在菌體表面的培養(yǎng)基，用Lysis equilibration buffer（LE Buffer）懸起菌體后進(jìn)行超聲破碎，設(shè)置破碎儀工作2 s、暫停5 s，超聲至菌液清亮、透明為宜，約需1.5 h。破碎結(jié)束后以上述同等條件離心，分別取40 μl上清液和沉淀各加入蛋白上樣緩沖液10 μl煮沸后點(diǎn)樣至SDS-PAGE蛋白凝膠孔中，設(shè)置電泳儀的工作電壓為200 V，約工作45 min。用考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后分析α毒素重組蛋白的表達(dá)水平。

1.6 重組蛋白的純化、濃縮

用LE Buffer平衡His-Tag Ni柱3～4次，將超聲破碎后的可溶性上清蛋白加入Ni柱，并將流出液反復(fù)加入Ni柱3～4次，使得重組蛋白與Ni柱充分結(jié)合。分別用LE Buffer、30 mM、50 mM、70 mM、90 mM、130 mM、250 mM咪唑LE Buffer進(jìn)行洗脫。LE Buffer、30 mM、50 mM、70 mM、90 mM咪唑清洗4個(gè)柱體積并收集最后流出的2 ml液體，130 mM、250 mM咪唑清洗并回收1個(gè)柱體積約為10 ml的清洗液，平衡、掛柱和清洗均采取約20滴/min的流速。分別取流穿液、LE Buffer和各個(gè)濃度的咪唑清洗液，用1.5中條件進(jìn)行電泳分析純化條件和純化后的純度。

將純化后的重組蛋白轉(zhuǎn)入用EDTA-鈉和EDTA煮沸處理過的透析袋中，透析袋長約10 cm為宜，將透析袋放置于0.01 mmol/L的PBS溶液中進(jìn)行透析，PBS的體積約是重組蛋白體積的100倍。透析完成后將透析袋置于PEG 8 000中，以有效地吸出重組蛋白中的水分，達(dá)到濃縮的目的。

1.7 α毒素蛋白的Western-Blot分析

按照1.5中條件進(jìn)行電泳，將蛋白膠置于半干轉(zhuǎn)膜儀中的PVDF膜上并用濾紙包裹，設(shè)置轉(zhuǎn)膜儀電壓為15 V，待工作40 min后將PVDF膜轉(zhuǎn)移至5%的脫脂奶粉中過夜封閉，次日用TBST清洗3～4次后，用酶標(biāo)記的鼠抗組氨酸抗體室溫孵育1 h。同樣用TBST清洗3～4次，每次5～8 min，最后顯色后曝光。

2 結(jié)果

2.1 α表達(dá)載體的構(gòu)建

瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR擴(kuò)增的基因條帶約1 194 bp，與預(yù)期值相符（圖1）。把此基因插入pET-30a載體后轉(zhuǎn)至E.coliDH5α感受態(tài)后擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證（圖2）。提取質(zhì)粒雙酶切檢驗(yàn)（圖3），最后將測(cè)序合適的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)中。

圖1 PCR擴(kuò)增α基因

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定

圖3 雙酶切鑒定

2.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

在16℃、28℃過夜誘導(dǎo)和37℃誘導(dǎo)5 h條件下，用0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L的IPTG篩選最佳的α毒素蛋白表達(dá)條件，結(jié)果表明IPTG的濃度為0.5 mmol/L時(shí)，采用37℃誘導(dǎo)5 h的表達(dá)條件，最有利于重組蛋白的表達(dá)（圖4）。

圖4 優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件

2.3 重組蛋白的純化

SDS-PAGE電泳檢測(cè)流穿液和各個(gè)濃度梯度的咪唑洗脫液，結(jié)果顯示90 mM咪唑LE Buffer中含有較多的雜蛋白，但130 mM咪唑LE Buffer中幾乎沒有雜蛋白的存在，篩選出了90 mM咪唑LE Buffer能與雜蛋白很好地結(jié)合，達(dá)到清洗的目的，用250 mM咪唑LE Buffer可與α重組蛋白結(jié)合后達(dá)到洗脫的目的（圖5）。將含有重組蛋白的250 mM咪唑的洗脫液裝入透析袋后置于PBS中透析，用PEG 8 000濃縮后于-80℃凍存。

圖5 優(yōu)化純化條件

2.4 重組蛋白免疫原性檢測(cè)

重組蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后采用半干轉(zhuǎn)模儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，其結(jié)果顯示約58 kD處存在特異性條帶（圖6）。

圖6 α毒素蛋白的免疫印跡反應(yīng)

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌病一般是多種菌型的梭菌混合感染致使動(dòng)物患病，無特別有效的治療措施，抗生素治療效果不明顯，病死率較大[9]。產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的α毒素是一種多功能金屬酶，該酶屬于致死性毒素，能夠水解細(xì)胞膜的磷脂雙分子，破壞細(xì)胞膜的完整性，從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，使機(jī)體發(fā)病[10]。α毒素的啟動(dòng)子可被大腸桿菌的聚合酶所識(shí)別從而啟動(dòng)該毒素基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，因此本試驗(yàn)選擇了原核表達(dá)載體pET30a和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，該蛋白的生產(chǎn)工藝成熟，且具有成本低、周期短的優(yōu)點(diǎn)。目前，對(duì)α毒素感染尚無有效的治療方法，免疫接種是預(yù)防該病的唯一途徑。由于該菌可寄生在腸道內(nèi)，屬于條件性致病菌，且該菌的致病過程是其分泌的毒素發(fā)揮作用。因此，單純地在機(jī)體中檢測(cè)該菌，不能說明是產(chǎn)氣莢膜梭菌病，在機(jī)體中檢測(cè)到相應(yīng)的毒素即可確診。本試驗(yàn)成功誘導(dǎo)表達(dá)了α毒素蛋白并對(duì)其進(jìn)行了純化，獲得了高純度、高濃度且具有生物學(xué)活性的α毒素蛋白，為地區(qū)性的產(chǎn)氣莢膜疫苗研發(fā)和進(jìn)一步研制本地區(qū)α抗體ELISA試劑盒奠定了基礎(chǔ)。