新疆地區A型產氣莢膜梭菌α毒素蛋白的原核表達

蘇 燕，蘇 艷

（1.新疆農業大學 動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆醫科大學第八附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830052）

產氣莢膜梭菌是主要分布于人畜糞便及腸道中的一類厭氧的條件性致病菌，最早稱為魏氏梭菌，該菌在分解動物組織的糖分時會產生大量氣體，且絕大部分菌株在生長過程中都有莢膜形成，因而稱之為產氣莢膜梭菌[1]。產氣莢膜梭菌在世界各地都有存在，給全球養殖業的發展帶來了嚴重影響[2]。其致病性主要來源于產氣莢膜梭菌分泌的毒素，不同毒素的致病機制不同，在眾多外毒素中α、β、ε和ι是最主要的[3]，這4種外毒素會對機體產生嚴重的毒害作用，威脅著人和動物的健康[4,5]。現階段將產氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E、F、G7個細菌型[6]，其中A型和C型對人的致病性極強[7]。所有的產氣莢膜梭菌都分泌α毒素，A型菌分泌的α毒素量最大[8]。研究新疆地區產氣莢膜梭菌α毒素蛋白對該區域產氣莢膜梭菌病的流行以及防治具有指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

質粒pET-30a載體（實驗室保存），商品化的感受態，質粒和基因組提取試劑盒、快切酶、T4快速連接酶，過硫酸銨、丙烯酰胺、青霉素、還原性谷胱甘肽、誘導劑（IPTG）、低溫離心機等。

1.2 設計引物

在NCBI網址中下載編碼α毒素基因序列，并去掉信號肽片段，該基因共計927 bp，設計α毒素基因的引物，將設計好的基因引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成，引物序列如表1所示，引物稀釋后凍存。

表1 產氣莢膜梭菌α毒素基因引物序列

1.3 擴增α毒素基因

用培養24 h后的A型產氣莢膜梭菌提取基因組，并以此為模板，用1.2合成的引物PCR擴增α毒素基因，將擴增產物加至1.2%瓊脂糖凝膠孔中，待電泳結束后回收α毒素基因片段。

1.4 重組質粒的構建

用快切酶EcolⅠ和SalⅠ雙酶切α毒素基因與pET-30a載體，于37℃水浴鍋中酶切20 min后回收酶切產物，酶切后的α毒素基因和pET-30a載體用連接酶過夜連接，次日轉入E.coliDH5α中，將感受態復蘇后用固體培養基培養，之后選單菌落在液體培養基中擴大培養，并以菌液為模板PCR擴增驗證，隨后提取質粒進行雙酶切鑒定并送至公司測序。

1.5 α毒素蛋白的誘導表達

將鑒定正確的重組質粒轉入大腸桿菌BL21中過夜培養，次日擴大培養后保存菌液。選取9個高壓滅菌過的搖菌瓶，每個加入200 ml含有抗生素的培養基和2 ml的菌液培養，待菌液OD600值達到0.4～0.8時，將誘導試驗分為3組，第一組為16℃過夜誘導，第二組為28℃過夜誘導，第三組為37℃誘導5 h。每組設置IPTG的濃度分別為0.25 mmol/L、0.5 mmol/L和1 mmol/L。收集誘導后的菌液至離心瓶中，低溫重復離心清洗黏附在菌體表面的培養基，用Lysis equilibration buffer（LE Buffer）懸起菌體后進行超聲破碎，設置破碎儀工作2 s、暫停5 s，超聲至菌液清亮、透明為宜，約需1.5 h。破碎結束后以上述同等條件離心，分別取40 μl上清液和沉淀各加入蛋白上樣緩沖液10 μl煮沸后點樣至SDS-PAGE蛋白凝膠孔中，設置電泳儀的工作電壓為200 V，約工作45 min。用考馬斯亮藍染色、脫色后分析α毒素重組蛋白的表達水平。

1.6 重組蛋白的純化、濃縮

用LE Buffer平衡His-Tag Ni柱3～4次，將超聲破碎后的可溶性上清蛋白加入Ni柱，并將流出液反復加入Ni柱3～4次，使得重組蛋白與Ni柱充分結合。分別用LE Buffer、30 mM、50 mM、70 mM、90 mM、130 mM、250 mM咪唑LE Buffer進行洗脫。LE Buffer、30 mM、50 mM、70 mM、90 mM咪唑清洗4個柱體積并收集最后流出的2 ml液體，130 mM、250 mM咪唑清洗并回收1個柱體積約為10 ml的清洗液，平衡、掛柱和清洗均采取約20滴/min的流速。分別取流穿液、LE Buffer和各個濃度的咪唑清洗液，用1.5中條件進行電泳分析純化條件和純化后的純度。

將純化后的重組蛋白轉入用EDTA-鈉和EDTA煮沸處理過的透析袋中，透析袋長約10 cm為宜，將透析袋放置于0.01 mmol/L的PBS溶液中進行透析，PBS的體積約是重組蛋白體積的100倍。透析完成后將透析袋置于PEG 8 000中，以有效地吸出重組蛋白中的水分，達到濃縮的目的。

1.7 α毒素蛋白的Western-Blot分析

按照1.5中條件進行電泳，將蛋白膠置于半干轉膜儀中的PVDF膜上并用濾紙包裹，設置轉膜儀電壓為15 V，待工作40 min后將PVDF膜轉移至5%的脫脂奶粉中過夜封閉，次日用TBST清洗3～4次后，用酶標記的鼠抗組氨酸抗體室溫孵育1 h。同樣用TBST清洗3～4次，每次5～8 min，最后顯色后曝光。

2 結果

2.1 α表達載體的構建

瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR擴增的基因條帶約1 194 bp，與預期值相符（圖1）。把此基因插入pET-30a載體后轉至E.coliDH5α感受態后擴大培養進行菌液PCR驗證（圖2）。提取質粒雙酶切檢驗（圖3），最后將測序合適的質粒轉入BL21（DE3）感受態中。

圖1 PCR擴增α基因

圖2 重組質粒PCR鑒定

圖3 雙酶切鑒定

2.2 誘導條件優化

在16℃、28℃過夜誘導和37℃誘導5 h條件下，用0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L的IPTG篩選最佳的α毒素蛋白表達條件，結果表明IPTG的濃度為0.5 mmol/L時，采用37℃誘導5 h的表達條件，最有利于重組蛋白的表達（圖4）。

圖4 優化誘導表達條件

2.3 重組蛋白的純化

SDS-PAGE電泳檢測流穿液和各個濃度梯度的咪唑洗脫液，結果顯示90 mM咪唑LE Buffer中含有較多的雜蛋白，但130 mM咪唑LE Buffer中幾乎沒有雜蛋白的存在，篩選出了90 mM咪唑LE Buffer能與雜蛋白很好地結合，達到清洗的目的，用250 mM咪唑LE Buffer可與α重組蛋白結合后達到洗脫的目的（圖5）。將含有重組蛋白的250 mM咪唑的洗脫液裝入透析袋后置于PBS中透析，用PEG 8 000濃縮后于-80℃凍存。

圖5 優化純化條件

2.4 重組蛋白免疫原性檢測

重組蛋白經12% SDS-PAGE電泳后采用半干轉模儀將蛋白轉至PVDF膜后進行免疫印跡反應，其結果顯示約58 kD處存在特異性條帶（圖6）。

圖6 α毒素蛋白的免疫印跡反應

3 討論

產氣莢膜梭菌病一般是多種菌型的梭菌混合感染致使動物患病，無特別有效的治療措施，抗生素治療效果不明顯，病死率較大[9]。產氣莢膜梭菌所產生的α毒素是一種多功能金屬酶，該酶屬于致死性毒素，能夠水解細胞膜的磷脂雙分子，破壞細胞膜的完整性，從而導致細胞裂解，使機體發病[10]。α毒素的啟動子可被大腸桿菌的聚合酶所識別從而啟動該毒素基因的轉錄翻譯，因此本試驗選擇了原核表達載體pET30a和大腸桿菌表達系統，該蛋白的生產工藝成熟，且具有成本低、周期短的優點。目前，對α毒素感染尚無有效的治療方法，免疫接種是預防該病的唯一途徑。由于該菌可寄生在腸道內，屬于條件性致病菌，且該菌的致病過程是其分泌的毒素發揮作用。因此，單純地在機體中檢測該菌，不能說明是產氣莢膜梭菌病，在機體中檢測到相應的毒素即可確診。本試驗成功誘導表達了α毒素蛋白并對其進行了純化，獲得了高純度、高濃度且具有生物學活性的α毒素蛋白，為地區性的產氣莢膜疫苗研發和進一步研制本地區α抗體ELISA試劑盒奠定了基礎。