雙重釋放雙氯芬酸鈉的可溶性透明質酸微針的制備與表征*

張 揚，劉光麗

(1.陸軍炮兵防空兵學院 機械工程系，安徽 合肥 230031；2.安徽醫科大學 生物醫學工程學院，安徽 合肥 230032)

微針技術作為一種新型的經皮給藥技術已經在生物制藥領域得到了廣泛的探索[1-2]。與傳統的皮下注射相比，微針技術最大的特點就是將傳統的注射針頭微型化，并以陣列的形式進行排列。經過微針技術的不斷發展，制備的材料已由傳統的不銹鋼等金屬材料向現在的透明質酸、麥芽糖等高分子聚合物發展[3-4]?，F如今大多數觀點認為，通過在血管豐富的真皮層中形成親水通道，微針可以促進藥物向全身循環傳遞，微針還可以促進藥物分子透過表皮和真皮進入皮膚深層組織[5-6]。其優勢是顯而易見的，如不會對皮膚造成損傷，易于醫護人員的管理、儲存和處理以及不會引起患者的疼痛等[7-8]。

透明質酸是一種非硫酸化的糖胺聚糖，在真皮中含量最高，它是維持皮膚水分的關鍵分子之一，具有獨特的保濕能力。在生物制藥領域已經嘗試將透明質酸輸送到皮膚中。雙氯芬酸鈉作為一種低成本的非甾體抗炎藥，在臨床上常用于鎮痛、抗炎、解熱等目的[9-10]，此藥物由于對胃腸道有較大的刺激，所以常常會限制其應用。在本文中將雙氯芬酸鈉與透明質酸結合制備可溶性微針，HA作為一種生物高分子材料，具有生物相容性和可生物降解性，并且HA和DS都是高度水溶性，因此選擇HA作為制備微針的聚合物基質。在微針表面覆蓋一層雙氯芬酸鈉粉末，探究了微針的制備工藝、機械強度和釋放特性等參數，在增加藥物輸送總量的同時減少透明質酸微針的吸濕性。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

材料：透明質酸粉末(hyaluronic acid, HA，醫用級，華熙福瑞達生物醫藥有限公司)、磺酰羅丹明B(sulforhodamine B, SRB，分析純，上海信裕生物科技有限公司)、雙氯芬酸鈉緩釋片(diclofenac sodium, DS，醫用級，江西仁和藥業有限公司)、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)微針模具(廣東微科有限公司)、豬皮(當地屠宰場)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS，?？寺∩锟萍加邢薰?、瓊脂糖(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

設備：202-OA真空干燥箱(南京華奧干燥設備有限公司)、紫外分光光度計Evolution 220(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 方法

微針制備過程如下：去離子水配置一定濃度梯度的HA與DS的水溶液。攪拌均勻后倒入制備好的PDMS微針模具中抽真空3 min，使HA水溶液完全浸入型腔中。為了避免混合液在高溫時過度失水，放置在37 ℃恒溫狀態下12 h完成干燥，取出微針，表面均勻涂抹DS顆粒。為了便于觀察，通常微針中摻入1%(體積分數)的SRB粉末。在真空干燥過程中，為控制溫度，將加濕器放置在真空干燥箱中設置37 ℃恒溫。利用濕度計讀數，通過控制加濕器的功率從而達到控制相對濕度的目的。具體的制備工藝如圖1所示。

圖1 微針制備工藝流程圖

取成年豬的腹部離體皮膚，去除多余的皮下脂肪后平鋪。將加入SRB的可溶性微針插入豬皮中，并保持插入狀態2 min后除去剩余的微針，此過程測試微針刺入皮膚的性能。將微針刺入封口膜后露出針尖的部分浸泡入10 mL的PBS緩沖液中，觀察微針在體外完全溶解的時間。稱取15 g的瓊脂糖粉末放置在100 mL的去離子水中，加熱攪拌至完全溶解，冷卻后得到透明瓊脂糖凝膠，將融合了SRB的HA微針完全刺入瓊脂糖凝膠中，確定微針在仿體模型中釋放藥物的情況。分別配制1～20 μg/mL的DS水溶液作為標準溶液，使用紫外分光光度計測得其在284 nm波長處有最大吸收，由此測定出DS水溶液的吸收-濃度標準曲線。在豬的腹部皮膚上進行體外透皮的試驗，并將試驗重復5次保證數據的可靠性，皮膚的平均厚度為(0.47±0.18)mm，對照組是濃度30%(質量分數)的DS溶液，1測試組是HA-DS微針，2測試組是微針表面涂覆DS的HA-DS微針，待微針穿刺皮膚并釋放DS 24 h后，取1 cm2皮膚放于5 mL水中，待皮膚中的DS全部溶于水中后，使用紫外分光光度計測定水中DS的吸收曲線，對照標準曲線確定樣本濃度。

2 結果與討論

2.1 微針尺寸表征結果

制備的微針陣列是15×15的圓錐陣列，底面直徑為380 μm，高度為860 μm，針尖距離為700 μm。微針陣列圖如圖2所示，圖2a和圖2b分別代表了表面未添加DS粉末和添加DS粉末的數碼相機圖；而圖2c和圖2d則是相對應的光學顯微鏡圖。由于HA具有吸濕性，所以常常會在高濕度的環境中潮解。將烘干后的HA表面均勻地覆蓋上DS粉末，由于微針的相對表面積減少，能有效阻止在高濕度下的微針的潮解。從圖2中可以看到，表面覆蓋了DS粉末相比沒有覆蓋DS粉末的微針能更長時間地保持微針結構的完整性。

a)未添加DS粉末的微針

2.2 HA濃度對微針成型的影響

HA濃度對微針的影響見表1。將溫度設定在37 ℃，控制HA的濃度后發現，在低濃度狀態下(20%)，由于HA的含量在水溶液中的比例過低，完全干燥后無法產生實心的微針。而當濃度過高時，由于溶液的粘度過大，在干燥過程中常出現氣孔、空腔等。分析主要原因是HA的濃度過高造成溶液流動性下降。經過反復試驗，認為HA濃度為50%的狀態下能夠制備完整的微針陣列，同時不會產生氣孔等缺陷，微針的制備性能主要受到HA濃度的影響。

表1 HA濃度對微針的影響

2.3 微針穿刺皮膚試驗

采用成年豬的腹部皮膚進行穿刺試驗模擬(見圖3)。由圖3可知，當微針插入皮膚后，皮膚中的組織液等溶液會溶解HA。皮膚表面的紅色點陣說明微針已經完全扎入豬皮中，而紅色的方框是因為微針四周的邊緣與皮膚相接觸，表明微針能與豬皮完全貼合而沒有在施加壓力的過程中發生脆斷。

圖3 微針穿刺皮膚實物圖

2.4 微針在PBS溶液中的溶解速率

試驗結果如圖4所示，表面覆蓋DS粉末的微針在顆粒的保護作用下剛開始溶解緩慢，在(11.15±0.13)s時，隨著微針表面覆蓋的DS的溶解，溶解速率增快；在(0.00±0.20)～(11.15±0.13)s時，無DS覆蓋的微針會由于較大的接觸面積快速溶解；在(30.03±0.15)s結束時，2種不同的微針的溶解速率相似。試驗結果驗證了當微針表面覆蓋DS時能夠有效控制微針的吸濕性。

圖4 微針的溶解速率圖

2.5 微針在仿體模型中的藥物釋放

微針的仿體釋放試驗如圖5所示，微針在瓊脂糖凝膠中不斷釋放SRB，紅色的區域隨著時間的增加而變大，開始時由于微針融入的SRB局部濃度較高，紅色釋放速度較快，隨著局部濃度的不斷降低，擴散速度逐漸變慢。在瓊脂糖凝膠中僅需要(12±0.25)h則完全停止擴散。

圖5 微針的仿體釋放試驗

2.6 微針在組織的體外透皮試驗

皮膚內DS的遞送量見表2。表2列出了表皮和真皮內DS的遞送量以及整體的遞送量結果，在皮膚內的總遞送結果顯示，對照組(30%的DS溶液)和1測試組(HA-DS微針)的遞送總量分別為(45.2±4.3)和(36±4.9)μg/cm2，2測試組(表面涂覆DS的HA-DS微針)的遞送總量為(103.9±3.4)μg/cm2，皮膚內DS的總遞送量明顯增加。此外，真皮層中的數據也顯示，表面涂覆DS的HA-DS微針可以更好地將藥物遞送到真皮層中。

表2 皮膚內DS的遞送量

3 結語

本文基于可溶性微針技術制備了包封雙氯芬酸鈉的雙重釋放微針，并就微針的機械強度、釋放速率和制備工藝等方面進行評價，拓展了其實際應用的可行性。雙重DS微針在傳統可溶性微針將藥物與HA互溶的基礎上，利用高分子材料特有的粘性，在表面進一步覆蓋DS顆粒，從而進一步擴大了載藥量，同時改善了水溶性微針容易吸水潮解的問題，對微針的臨床應用和深入研究有著一定的參考價值。