原發性帕金森病及部分帕金森疊加綜合征患者腸道炎癥及腸道通透性分析

項 志，夏丹豪，秦 馳，孟 琳，田海燕，劉 晗，滕軍放

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

原發性帕金森病(idiopathic Parkinson′s disease,iPD)是較為常見的慢性神經系統變性性疾病，其病理特點是黑質紋狀體多巴胺神經通路漸進性和選擇性變性缺失以及α-突觸核蛋白(alpha-synuclein,α-syn)包涵體病理性沉積[1]。該病的發病機制和病理過程尚不明確，目前普遍認為iPD的發生是遺傳因素和環境因素共同作用的結果[2]。帕金森疊加綜合征(Parkinson plus syndrome,PPS)是一系列臨床癥狀與iPD相似，但病理表現不同的神經變性性疾病，以多系統萎縮(multiple system atrophy,MSA)、路易體癡呆(dementia with Lewy body,DLB)居多。錯誤折疊的α-syn在神經系統內異常沉積并在細胞內形成病理性包涵體是iPD、MSA、DLB共同的病理特征，因此該類疾病被統稱為α-syn病[1-2]。大量體內外研究[1,3]發現，α-syn包涵體在神經系統內形成并播散是α-syn病的主要致病機制。近年來，有學者[4]提出，腸道微生態環境紊亂可能在中樞性α-syn病病理進展中發揮重要作用。此外，臨床研究[5]發現iPD及PPS患者多伴有明顯的胃腸道癥狀，并且多為患者的首發癥狀。已有研究[6]表明，iPD患者的腸道通透性高于正常人群，結腸活檢結果顯示組織中炎癥細胞因子表達量明顯增高。鑒于iPD、MSA、DLB具有相似的病理表現，我們猜想腸道炎癥反應和腸道通透性改變可能是iPD及部分PPS共有的特征，并且在疾病的發生和病程進展中發揮重要作用。本研究通過檢測iPD、MSA、DLB患者血漿和糞便中炎癥標志物水平以及糞便和結腸組織腸道通透性標志物，并通過病理活檢觀察腸道黏膜組織結構和病理改變，進一步探索腸道微生態環境改變在iPD及部分PPS病程進展中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2018年9月至2020年6月于鄭州大學第一附屬醫院神經內科門診就診及住院的52例iPD、28例MSA、21例DLB患者，均由兩位神經內科運動障礙方面的專家共同診治。納入標準：①iPD符合國際帕金森病和運動障礙協會(MDS)2015年帕金森病的臨床診斷標準[7]；MSA符合2008 年修訂的Gilman診斷標準[8]；DLB符合2005年DLB國際研究協作組提出的診斷標準[9]。②無胃腸道疾病病史和胃腸手術史。③近3個月無抗菌藥物、胃腸藥物、益生類食物或飲品服用史。④飲食習慣為雜食，無其他特殊飲食習慣。⑤無創傷性腦損傷史、腦腫瘤、其他神經系統疾病。⑥接受抽血及糞便收集、檢查。35名健康對照來自門診招募，入組標準：①未被診斷過帕金森病、其他神經或精神疾病。②～⑥同上述。iPD、MSA、DLB患者各8例接受結腸活檢，健康對照組有5人接受結腸活檢。活檢前1周均未服用抗凝藥物和抗血小板藥物，均無腸道活檢禁忌證。所有受試者均進行全面的病史采集，包括性別、年齡、癥狀、起病時間、家族史、工作性質、生活環境、吸煙飲酒史、中毒史、外傷史、神經系統病變危險因素接觸史、其他慢性疾病史等。iPD患者的疾病嚴重程度由HoehnYahr(H-Y)分期進行評價，MSA患者的疾病嚴重程度由UMSARS評分進行評價，DLB患者的疾病嚴重程度由簡易智力狀態檢查量表(Mini-mental State Examination，MMSE)進行評價。本研究通過鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會審批。136人均為自愿參與本研究，參與結腸活檢者均簽署知情同意書。

1.2 血漿和糞便中腸道炎癥及腸道通透性指標的檢測血漿標本的收集：健康對照者晨起空腹取血，iPD、MSA、DLB患者入院后次日晨起空腹取血3 mL，肝素抗凝，靜置1～2 h，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清。-80 ℃冰箱中保存備用。

糞便標本的收集及預處理：iPD、MSA、DLB患者入院后次日使用干凈的集便器采集糞便標本，健康對照者留取糞便，裝入滅菌的凍存管，并于2 h內轉移至-80 ℃冰箱保存備用。使用無菌接種環取500 mg糞便標本置于試管內，加入50 mL PBS，充分振蕩混勻，取2 mL，14 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS洗滌，收集沉淀，重復3次。標本預處理完成后，存于-80 ℃冰箱備用。

ELISA：用ELISA試劑盒(Elabscience公司)分別檢測血漿中腸道炎癥標志物內毒素結合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)水平，糞便中腸道炎癥標志物糞鈣衛蛋白(fecal calprotectin，FC)、腸道通透性標志物糞α-1-抗胰蛋白酶(fecal alpha-1-antitrypsin，FAT)和糞連蛋白(fecal zonulin，FZ)水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。連續檢測3次，取均值。

1.3 結腸黏膜組織中腸道通透性指標的檢測根據消化內科內鏡處的標準程序進行結腸鏡檢查及活檢。使用標準活檢鉗(MTN-BF-23/16-A，南京Micro-tech公司)采集活組織標本，每位受檢者于升結腸處分別取3塊黏膜組織。標本收集完成后用生理鹽水充分清洗，快速置于福爾馬林中固定及液氮低溫凍存。

免疫組化染色：取標本，常規梯度乙醇脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片。60 ℃烘片2 h后取出，經二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水透明，PBS清洗3次，每次5 min。玻片置于枸櫞酸鈉緩沖液中進行高溫高壓抗原修復5 min,冷卻后PBS洗滌1次，5 min；體積分數為3%的Triton溶液孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；山羊血清封閉液封閉30 min，加入一抗工作液，抗Occludin抗體、抗ZO-1抗體(Thermo公司)均按1∶200稀釋，抗E-cadherin抗體(Abcam公司)1∶600稀釋，抗磷酸化α-syn(Pα-syn)抗體(Millipore公司)1∶300稀釋，濕盒內4 ℃孵育24 h。室溫下復溫1 h，PBS洗滌3次，每次5 min；辣根過氧化物酶標記的二抗工作液(羊抗鼠 IgG，北京博奧森公司，1∶1 500稀釋)孵育30 min，PBS洗滌3次。DAB顯色,蘇木精復染,梯度乙醇脫水，二甲苯透明，甘油封片。使用Olympus BX43顯微鏡觀察并拍照(×400)，每張切片選取3個視野，使用Image J軟件統計免疫陽性染色(棕黃色)面積百分比。

免疫熒光雙標染色：取標本，同上石蠟包埋、切片、修復抗原、Triton溶液孵育后，加入一抗工作液，抗Occludin抗體和抗ZO-1抗體(Thermo公司)按1∶600稀釋，抗Pα-syn抗體(Abcam公司)1∶800稀釋，腸道神經纖維標志物抗PGP9.5抗體(Abcam公司)1∶600稀釋，濕盒內4 ℃孵育24 h。室溫下復溫1 h，PBS洗滌3次，每次5 min；加熒光二抗避光孵育3 h，PBS洗滌3次，每次10 min；Hochest33258染色液(1∶1 000稀釋，北京索萊寶公司)染核，PBS洗滌1次5 min，甘油封片。使用Olympus BX43顯微鏡觀察并拍照。

1.4 統計學處理用SPSS 22.0處理數據。多組間年齡、病程，結腸黏膜組織中Occludin、ZO-1、E-cadherin、Pα-syn表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；采用Kruskal-Wallis秩和檢驗比較多組間血漿中LBP水平，糞便標本中FC、FAT、FZ水平的差異，兩兩比較采用Bonferroni法；采用χ2檢驗分析多組間性別、Pα-syn染色陽性率的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組基本資料的比較結果見表1。由表1可知，各組間年齡、性別、病程差異均無統計學意義(P>0.05)。iPD組H-Y評分為2.30±0.67，MSA組UMSARS評分為32.25±11.26，DLB組MMSE評分為14.72±5.41。

表1 4組基本資料的比較

2.2 4組血漿及糞便中腸道炎癥及通透性標志物表達水平的比較與健康對照比較，iPD、MSA患者血漿LBP水平降低，糞便中FC、FAT、FZ水平升高(表2)。

表2 4組血漿LBP和糞便FC、FAT、FZ水平比較

2.3 4組結腸黏膜組織中腸道通透性指標及Pα-syn的表達免疫熒光雙標染色結果(圖1)顯示：Occludin和ZO-1在健康對照和DLB患者腸道黏膜中沿細胞膜均勻分布，光滑連續；在iPD和MSA患者腸道黏膜中沿細胞膜不連續分布，表達水平明顯降低。iPD、MSA、DLB患者腸道黏膜中Pα-syn沉積于神經元(PGP9.5標志)內。健康對照組、iPD組、MSA組、DLB組Pα-syn陽性率分別為20.0%(1/5)、62.5%(5/8)、37.5%(3/8)、50.0%(4/8)，4組間比較，差異無統計學意義(χ2=2.517，P=0.472)。與健康對照比較，iPD、MSA患者結腸黏膜組織中Occludin、ZO-1、E-cadherin表達水平降低，iPD、MSA、DLB患者Pα-syn大量沉積(圖2、表3)。

A、B、C、D：分別為健康對照，iPD、MSA、DLB患者圖1 iPD、MSA、DLB患者及健康對照結腸黏膜組織免疫熒光雙標染色(×400)

A、B、C、D：分別為健康對照，iPD、MSA、DLB患者圖2 iPD、MSA、DLB患者及健康對照結腸黏膜組織免疫組化染色(SP，×400)

表3 4組結腸黏膜組織中Occludin、ZO-1、E-cadherin、Pα-syn表達水平的比較 %

3 討論

帕金森病的腸道起源學說近年來日益受到重視。大量研究[10-11]發現Pα-syn陽性包涵體在iPD患者中沿腸神經系統病理性沉積，且早于中樞癥狀出現。遺傳學研究[12-13]顯示，部分iPD和炎癥性腸病患者(如潰瘍性結腸炎、克羅恩病)具有相同的遺傳背景，炎癥性腸病患者中帕金森病的發病率明顯高于健康人群。此外，研究[14]表明，腸道菌群紊亂會加重帕金森病小鼠模型的癥狀和病理表現。Braak等[15]提出的α-syn在腸道中沉積并沿迷走神經逐漸向上播散至中樞神經系統引起帕金森病表型的理論為此學說奠定了基礎。此外，腸道微生態的改變可能在帕金森病的發病與病程進展中發揮重要作用[4,16]。

腸-腦軸的提出為α-syn病的研究提供了新思路。Devos等[17]發現iPD患者早期即有明顯的腸道炎癥反應。動物實驗[18]證明，在帕金森病模型小鼠中，外源性給予化學致炎物質后，小鼠的行為學改變明顯提前，并且提前表現出腸道和腦神經元內α-syn病理性沉積、紋狀體和黑質多巴胺能神經元數量減少以及腸道和腦中炎癥標志物水平升高。以上研究表明，腸道炎癥改變可能會加重iPD的病理變化。基于iPD、MSA、DLB相似的病理特征，我們推測腸道炎癥和腸道通透性增加可能是iPD和部分PPS共同的病理變化，并且可能會促進疾病進展。

LBP是一種與LPS結合的急性期蛋白[19]。血漿LBP水平可以反映全身細菌LPS暴露情況[20]。FC由活化的中性粒細胞釋放，是腸道炎癥的敏感糞便標記物，可以反映亞臨床炎癥；而FAT和FZ是反映腸道黏膜完整性的敏感指標[21]。腸黏膜屏障是保護腸道免受有害物質侵入的重要結構，主要由腸上皮細胞和細胞間連接構成，細胞間連接由緊密連接、縫隙連接、黏附連接和橋粒連接等組成，其中緊密連接最為重要，Occludin和ZO-1是構成腸上皮細胞緊密連接的主要蛋白；E-cadherin水平可以反映腸上皮黏附連接的功能狀況[22]。我們發現iPD、MSA患者血漿LBP水平低于健康對照組，糞便中FC、FAT、FZ水平均高于健康對照組，結腸腸道通透性增加，由此進一步證明了iPD、MSA患者存在腸道炎癥且腸黏膜屏障受到破壞。我們的研究雖然未能證明腸道改變是發生于iPD、MSA發病之前還是繼發于iPD、MSA之后，但是既往的研究[23]顯示，腸道炎癥和通透性改變可能早于中樞神經系統病變出現，并且在促進iPD和PPS的疾病進程中發揮重要作用。

腸道LPS暴露介導的炎癥級聯反應可以誘導局部和全身炎癥改變，引起促炎因子分泌以及氧化應激水平增加，進而引起中樞神經系統病變[24]。有研究[19,25]提出，iPD可能是由一種破壞腸黏膜屏障的環境病原菌所引起，腸道中潛在的嗜神經物質侵入黏膜下神經叢，進一步通過迷走神經節前神經播散至中樞神經系統，炎癥反應也可以通過迷走神經播散至下腦干，進而通過基底中腦和前腦，到達大腦皮層，導致iPD病理性改變。我們發現Pα-syn在iPD、MSA、DLB患者腸道神經元內廣泛沉積，可能與腸道炎癥反應及通透性改變有關，這仍需要進一步的實驗證實。同時，關于DLB是否伴有腸道結構和功能改變亦需要進行進一步研究證明。

綜上所述，腸道炎癥反應和腸道通透性改變與iPD及PPS疾病病程進展有關。該結論為尋找iPD及部分PPS早期診斷標志物提供了新思路。改善腸道微環境有望成為改善iPD及部分PPS癥狀、延緩疾病進程的手段。