血小板體外對中性粒細胞抗真菌作用的影響

司 瑋，張芬芬，王春梅，劉素素，岳 娟，簡守珺，張紅敏

1)鄭州大學人民醫院眼科；河南省立眼科醫院；河南省眼科學與視覺科學重點實驗室 鄭州 450003 2)德州市人民醫院眼科 山東 德州 253003

真菌性角膜炎是一種臨床上常見的致盲性、真菌感染性眼病，是我國角膜移植的主要原因[1-3]。真菌性角膜炎免疫反應過程中，中性粒細胞發揮著關鍵的抗真菌作用[4-6]。我們前期的研究顯示，血小板圍繞真菌性角膜炎小鼠模型真菌感染病灶形成血小板浸潤帶；腹腔注射血小板中和抗體去除血小板后，真菌性角膜炎感染嚴重，菌絲量大，角膜臨床癥狀加重；提示血小板參與了角膜的抗真菌感染過程(未發表資料)。近來許多研究[7-10]表明，血小板除了在血栓形成和止血中發揮調節功能外，在免疫防御方面也發揮著重要作用。我們采用中性粒細胞、血小板和真菌體外共培養的方法，觀察血小板的體外抗真菌作用，為真菌性角膜炎的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1實驗試劑 RPMI 1640培養液、紅細胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(青島海博生物技術有限公司)；EDTA-K2抗凝管(湖南三力醫用科技發展有限公司)；Percoll分離液(美國GE Healthcare公司)；瑞姬氏染液(南京建成科技有限公司)；鈣熒光白(美國Fluka公司)；抗人CD41a-PE、抗人CD15-FITC、FITC-Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)。

1.1.2實驗儀器 細胞培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)、真菌生化培養箱(中國廣東省醫療器械廠)、離心機(美國Beckman Coulter公司)、微量移液器(法國Gilson公司)、轉盤共聚焦顯微鏡(英國Andor公司)。

1.2 真菌菌株來源及真菌孢子的提取腐皮鐮胞菌標準株，編號3.5840，購自中國科學院微生物研究所，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基培養于28 ℃霉菌培養箱內。參考文獻[11]方法，選取培養4～7 d、狀態良好的菌株用于實驗。于培養真菌菌株的玻璃試管中，加入2～3 mL無菌RPMI 1640培養液，用無菌吸管輕輕從瓊脂斜面刮取真菌菌落，吹打混勻，使真菌菌絲和孢子懸浮，用對折兩次的無菌紗布將真菌混懸液過濾，濾除菌絲，將包含孢子的濾液收集至無菌離心管中并300×g離心5 min，收集孢子，用血細胞計數板顯微鏡下計數孢子數目，置于冰盒中備用。

1.3 人外周血血小板和中性粒細胞的分離

1.3.1人外周血來源 健康志愿者入選標準：年齡18～35歲；15 d內無感染性疾病發生，3個月內未應用抗生素；無全身性疾病；6個月內無獻血史。排除妊娠和生理期女性。本研究通過河南省立眼科醫院醫學倫理委員會的審批，批準號：HNEECKY-2018(1)。單次采集健康志愿者外周靜脈全血15 mL至EDTA-K2抗凝管中，顛倒混勻后300×g離心10 min。上層為富血小板血漿層，下層為細胞層。

1.3.2血小板的分離 參考文獻[11]方法，全血離心后，吸取上層富血小板血漿于新離心管中600×g離心10 min，白色沉淀即為血小板。取2 μL血小板沉淀均勻涂布于載玻片上，用瑞姬氏染液染色后在光學顯微鏡下進行純度計數，選取純度大于95%的血小板進行實驗。取血小板,加入1 mL培養基輕輕重懸，制成均勻的血小板懸液，用血細胞計數板在顯微鏡下計數，置于常溫備用。

1.3.3中性粒細胞的分離 全血離心后，收集下層細胞層至離心管內，加入細胞層3倍體積的紅細胞裂解液，混勻，冰盒中避光裂解10～12 min，300×g離心5 min，白色沉淀即為白細胞層。使用Percoll梯度離心法600×g離心20 min得到中性粒細胞[12]。經純度鑒定后制備細胞懸液并計數，方法同1.3.2，置于常溫備用。

1.4 中性粒細胞吞噬率測定實驗分為孢子(S)+中性粒細胞(N)組和S+N+血小板(PL)組。預先分別用體積分數0.2%鈣熒光白(藍色)、抗人CD15-FITC(綠色)和抗人CD41a-PE(紅色)標記孢子、中性粒細胞和血小板。將中性粒細胞均勻接種于12孔板中，每孔5×105個，每組接種2孔。S+N組按照孢子∶中性粒細胞個數1∶1的比例加入孢子；S+N+PL組按照孢子∶中性粒細胞∶血小板個數1∶1∶20的比例加入孢子和血小板；用RPMI 1640培養液將每孔定容至1.5 mL并將孔板放入轉盤共聚焦顯微鏡活細胞孵育培養系統(37 ℃、體積分數5%CO2、95%濕度)內進行培養，分別于培養1、2、4 h后每組選取20倍物鏡下5個視野拍照。將各通道熒光圖片與光學圖片融合后，計數5個視野中的中性粒細胞總數、吞噬孢子的中性粒細胞數。中性粒細胞吞噬率=吞噬孢子的中性粒細胞數/中性粒細胞總數×100%。實驗重復8次。

1.5 孢子出芽率和菌絲伸長度測定實驗分為S組、S+N組、S+N+PL組，S∶N∶PL個數比例為1∶5∶100。將中性粒細胞均勻接種于12孔板中，每孔5×105個，每組接種2孔，余鋪板、染色及計數方法同1.4。①分別于培養1、2、4 h后每組選取20倍物鏡下5個視野拍照。將各通道熒光圖片與光學圖片融合后，計數5個視野中出芽孢子個數及孢子總數。孢子出芽率=出芽孢子個數/孢子總數×100%。實驗重復7次。②分別于培養4、6、8 h后，每組選取20倍物鏡下5個視野拍照，用Imaris 7.2測量視野內所有完整真菌菌絲長度。實驗重復7次。

1.6 中性粒細胞凋亡率測定實驗分為N組、S+N組、S+N+PL組，S∶N∶PL個數比例為1∶5∶100。將中性粒細胞均勻接種于12孔板中，每孔5×105個，每組接種2孔，培養條件同1.4。分別于培養6、10、14、18 h后，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作檢測凋亡的中性粒細胞。在相應孔內加入Annexin V和PI試劑，避光孵育15 min后放置于轉盤共聚焦顯微鏡的活細胞孵育培養系統中，每組在20倍物鏡下選取5個視野拍照。僅Annexin V著染的為早期凋亡細胞，Annexin V與PI雙染的為晚期凋亡細胞。計數5個視野中熒光著染的中性粒細胞數及中性粒細胞總數。中性粒細胞凋亡率=熒光著染的中性粒細胞數/中性粒細胞總數×100%。實驗重復6次。

1.7 統計學處理采用SPSS 21.0進行統計分析。各組間中性粒細胞吞噬率及凋亡率、孢子出芽率的比較采用單因素方差分析(兩兩比較采用LSD-t檢驗)或兩獨立樣本的t檢驗；菌絲伸長度為非正態分布，同一時間點組間比較均采用Kruskal-WallisH檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 S+N組和S+N+PL組中性粒細胞吞噬率的比較見圖1、表1。S+N+PL組中性粒細胞吞噬率大于S+N組。

藍色：孢子；綠色：中性粒細胞；紅色：血小板；白色箭頭示中性粒細胞吞噬真菌孢子圖1 兩組中性粒細胞吞噬真菌孢子的表現

表1 S+N組和S+N+PL組中性粒細胞吞噬率的比較 %

2.2 3組孢子出芽率和菌絲伸長度的比較見圖2、3和表2。S+N+PL組孢子出芽率和菌絲伸長度小于S+N組和S組；S+N組孢子出芽率小于S組，6 h時的菌絲伸長度小于S組。

表2 3組孢子出芽率和菌絲伸長度比較

2.3 3組中性粒細胞凋亡率的比較見圖4、表3。S+N+L組中性粒細胞凋亡率小于S+N組和N組。

藍色：孢子；綠色：中性粒細胞；紅色：血小板；白色箭頭示孢子出芽圖2 3組孢子出芽的表現

藍色：孢子；綠色：中性粒細胞；紅色：血小板；白色箭頭示真菌菌絲；黑色箭頭示為被中性粒細胞包裹的菌絲圖3 3組菌絲的表現

藍色：真菌；綠色：Annexin V染色；紅色：PI染色；白色箭頭示早期凋亡細胞；黑色箭頭示晚期凋亡細胞圖4 3組中性粒細胞凋亡現象

表3 3組中性粒細胞凋亡率比較 %

3 討論

大量文獻[9-11]顯示，天然免疫的早期應答對真菌感染的轉歸起著決定性作用。天然免疫細胞包括中性粒細胞、巨噬細胞等，它們不但可直接吞噬真菌孢子或胞外捕獲真菌菌絲，分泌抗真菌成分，產生的化學因子和細胞因子還可啟動獲得性免疫，其中中性粒細胞起著尤為重要的作用[4-6,13]。中性粒細胞減少者易患黏膜真菌病，且真菌很容易播散[14]。真菌感染的角膜各層中均有大量多形核中性粒細胞浸潤，細胞的分布和浸潤程度與菌絲的分布和密度呈負相關。

血小板是骨髓巨核細胞脫落下來的胞質小塊，在外周血中的壽命為8～10 d。血小板是除紅細胞外，數量最多的血液有形成分，以往認為其主要參與止血、血栓形成和傷口愈合等病理生理過程，近年來人們發現血小板具有重要的免疫功能，在天然免疫和獲得性免疫以及炎癥等方面發揮重要作用[10-11，14-15]。Chatterjee等[16]報道，抗體依賴的血小板去除鼠角膜上皮被刮除后，角膜創傷部位中性粒細胞明顯減少，創傷愈合明顯延遲[16]。最近的研究[17]表明：中性粒細胞的殺菌作用依賴于血小板的參與，如中性粒細胞殺滅瘧原蟲的作用依賴于血小板的活化和聚集，革蘭陰性菌感染的牙周組織中白細胞的吞噬功能依賴于血小板、血漿因子和TLR2。

已有研究[18]在分析白色念珠菌引起的全身性念珠菌病與全血的關系時，認為以小鼠中性粒細胞、白色念珠菌與血小板個數按1∶10∶100的比例用于實驗較為合適。本研究以該濃度為基準進行預實驗，最終以血小板與孢子個數按20∶1的比例進行實驗。結果顯示，加入血小板后中性粒細胞對真菌的吞噬作用增強，且真菌孢子的出芽率和菌絲伸長度下降，中性粒細胞凋亡率降低，表明血小板可增強中性粒細胞對真菌的吞噬，且對菌絲生長有抑制作用。

Haselmayer等[19]的研究結果表明血小板可促進中性粒細胞的活化，激活中性粒細胞呼吸爆發，釋放IL-8和髓過氧化物酶等多種物質。Chatterjee等[16]的研究結果顯示血小板衍生的CXCL12可通過CXCR7促進單核細胞的存活，從而顯著抑制單核細胞凋亡。Au等[20]的研究結果表明活化的血小板可釋放一種非典型的表皮生長因子受體激動劑，該激動劑通過旁分泌信號，維持依賴于DNA依賴蛋白激酶的DNA修復，從而有效抑制神經細胞凋亡。我們推測血小板增強中性粒細胞的抗真菌作用可能是通過促進中性粒細胞活化，激活中性粒細胞呼吸爆發，釋放髓過氧化物酶等多種殺真菌效應物質來實現的，但是具體的作用機制尚待進一步研究。

本研究應用血小板、中性粒細胞和腐皮鐮孢菌共培養體系，采用免疫熒光和轉盤共聚焦技術，證實了血小板體外可增強中性粒細胞對真菌的吞噬，抑制真菌的出芽和菌絲的生長，同時降低中性粒細胞的凋亡，提示血小板在抗真菌感染中發揮了重要作用，這為真菌性角膜炎的治療提供了新思路。