男性不育和性發育異常病例中27個序列標簽位點的應用價值

王紅丹，李永樂，汪濟海，蘇俊祥，馮戰啟

1)鄭州大學人民醫院；河南省人民醫院醫學遺傳研究所 鄭州 450003 2)國家衛生健康委員會出生缺陷預防重點實驗室；河南省人口缺陷干預技術研究重點實驗室；河南省生殖健康科學技術研究院 鄭州 450014 3)鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州 450052 4)鄭州市第一人民醫院泌尿外科 鄭州 450004

Y染色體無精子癥因子(azoospermia factor,AZF)微缺失是指Y染色體長臂上AZF區域發生微小的DNA片段缺失[1],是造成不育的重要遺傳因素。性發育異常在不孕不育患者中占有相當大的比例，最常見的性發育異常類型是克氏綜合征[2-3]。因此，針對不育和性發育異常患者，不僅僅要關注AZF的微缺失，更要關注性染色體異常的發生。本研究采用27個序列標簽位點(sequence tagged site,STS)，運用復合熒光多重PCR-毛細管電泳DNA片段分析技術對AZF微缺失與性染色體倍型進行聯合檢測，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2019年10月至2020年8月到河南省人民醫院就診的不育、性發育異常、性功能異常、尿道下裂、兩性畸形等或超聲提示胎兒生殖器官發育異常的91例患者，其中社會性別為女性5例，社會性別為男性85例，胎兒1例(孕25周)。

1.2 樣本采集及DNA提取抽取90例患者外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝；抽取胎兒羊水10 mL。采用柱式DNA提取試劑盒(上海生物工程有限公司)，按照說明書進行DNA提取操作。使用Qubit 3.0(美國Invitrogen公司)進行DNA樣本濃度的檢測。將DNA濃度調整至50 mg/L，4 ℃保存備用。

1.3 AZF微缺失的瓊脂糖凝膠電泳檢測針對Y染色體是否發生AZF微缺失，共檢測15個STS(亞能生物技術深圳有限公司)。其中，6個STS是歐洲男科協會(European Academy of Andrology,EAA)/歐洲分子遺傳質量協作網(European Molecular Genetics Quality Network,EMQN)于1999年和2004年提出建議采用的必檢位點：AZFa區(sY84和sY86)，AZFb區(sY127和sY134)以及AZFc區(sY254和sY255)。8個STS用于確認是否整段完全缺失：AZFa區(sY82、sY1064、sY1065和sY88)以及AZFb區(sY105、sY121、sY1192和sY153)。1個為異染色體標簽(sY160)。按照說明書進行瓊脂糖凝膠電泳操作。

1.4 AZF微缺失與性染色體倍型拓展檢測采用27個STS，運用復合熒光多重PCR-毛細管電泳DNA片段分析技術對AZF微缺失與性染色體倍型拓展進行檢測，試劑購自上海精準生物醫藥有限公司，具體檢測區域和擴增位點見表1。

表1 27個STS的名稱及功能說明

1.5 G顯帶染色體核型分析對于27個STS檢測結果顯示性染色體異常的患者，抽取其靜脈血5 mL，肝素抗凝，4 ℃保存。血液接種于RPMI 1640培養基中培養，常規制片染色，鏡檢30個分裂象，分析患者的染色體核型。

1.6 比較基因組雜交芯片(array comparative genomic hybrization，aCGH)分析對于27個STS檢測結果顯示性染色體存在嵌合的患者，在染色體核型分析的同時進行aCGH分析。采用美國Agilent array平臺、SurePrint G3 Human CGH Microarray 8×60K芯片對全基因組進行檢測，分辨率為200 kb。

2 結果

2.1 AZF微缺失檢測結果85例社會性別男性患者中，檢見9例AZF微缺失(AZFa、AZFb和AZFc區全缺失3例，AZFc區不全缺失5例，AZFb區不全缺失1例)。5例社會性別為女性的患者中，除1例AZFa、AZFb和AZFc區不存在微缺失，其余4例檢測區域全缺失;1例疑似外生殖器異常的胎兒未檢見AZF微缺失。總體異常檢出率為11.0%(10/91)。

2.2 AZF微缺失與性染色體倍型拓展檢測結果以及特殊病例檢測峰圖9例AZF微缺失的社會性別男性患者中，此種方法檢測出同樣的缺失，不同的是，1例不全缺失患者本檢測方法檢見了合并性染色體異常，2例全缺患者檢見合并性染色體異常；檢見12例患者性染色體存在異常。5例社會性別為女性的患者中，檢見1例患者AZFa、AZFb和AZFc區不存在缺失(和瓊脂糖凝膠電泳檢測結果相同)且提示性染色體異常，1例患者存在性染色體異常。1例胎兒存在性染色體異常，推測可能存在性染色體嵌合可能。性染色體異常檢出率為19.8%(18/91)，總體異常檢出率為26.4%(24/91)。18個性染色體異常患者檢測結果及臨床診斷見表2。1號樣本和3號樣本檢測發現都存在Y染色體片段[以1號樣本為例，檢測峰圖見圖1(A)]；樣本18檢測發現可能存在性染色體嵌合，檢測峰圖見圖1(B)。

2.3 染色體核型分析結果對提示性染色體異常的患者進行染色體核型分析，結果顯示，47,XXY患者10例，女性性反轉3例，男性性反轉1例，48,XXYY患者1例，47,XY,i(X)(q10)患者1例，45,X患者1例，45,X[20]/46,XY[10]胎兒1例。18號胎兒樣本結果與27個遺傳標記檢測結果相互印證。1號樣本沒有陽性發現。結果見表2。

表2 18個性染色體異常患者性染色體倍型檢測結果、染色體核型分析結果及臨床診斷

A：1號樣本檢見AZF全段缺失，且提示X染色體存在兩條；B：18號樣本未檢見AZF微缺失，但提示性染色體可存在嵌合，Y染色體可能有片段留存圖1 1號樣本與18號樣本27個STS檢測結果

2.4 特殊病例aCGH分析驗證結果為了進一步驗證1號和18號樣本的檢測結果，我們對這兩個樣本進行了aCGH檢測。1號樣本檢測結果為arr[hg19](X)×2,Yp11.31p11.2(2654831-8875193)×1，Y染色體留存區域大小為6.22 Mb，拷貝數為1。18號樣本檢測結果為arr(X)×1,(Y)×0～1。aCGH核型圖見圖2。aCGH檢測結果與27個遺傳標記檢測結果相互印證。

A：1號樣本aCGH檢測結果顯示，與正常女性相比存在Y染色體片段拷貝數增加；B：18號樣本aCGH檢測結果顯示，與正常男性相比，Y染色體拷貝數減少圖2 1號樣本與18號樣本aCGH核型圖

3 討論

Y染色體AZF微缺失是男性精子生成障礙的常見原因，是導致男性不育的重要因素。不同地區、不同種族的男性不育人群中AZF微缺失比例為3.0%～55.0%[4]，中國人群AZF微缺失率在不育人群中為14.8%[5]。2004年EAA/EMQN關于Y染色體微缺失分子診斷最佳實踐指南以及中國男科協會均已將Y染色體AZF檢測推薦為無精、嚴重少精癥患者確診以及輔助生殖前的必檢項目。

染色體異常是引起男性不育的重要因素之一，約6.0%的男性生精異常是由染色體異常導致[6]，其中性染色體異常約占1/3[7]。克氏綜合征仍然是目前男性無精癥的第一遺傳因素[8]。性染色體異常包括性染色體數目異常、結構異常、性反轉以及性染色體嵌合等，是性發育異常的常見因素[9]，可導致第二性征發育不全、性器官發育異常、原發或繼發閉經、兩性畸形以及不孕不育等。因此如果對AZF和性染色體數目等異常進行同時檢測，無疑將大大提高異常檢出率，能更好地指導臨床診療。本研究僅對AZF進行檢測，總體異常檢出率為11.0%，應用27個STS檢測系統進行檢測后，總體異常檢出率為26.4%，檢出率提高了近3倍。本檢測系統性染色體異常檢出率為19.8%。因此對AZF微缺失和性染色體數目等異常進行同時檢測非常有意義。以往常用的檢測系統主要是EAA/EMQN推薦的6個AZF區必檢位點，有的實驗室增加到15個STS位點，但也都是分布于AZF區；而本檢測系統除了增加AZF區檢測位點，實現AZF6個必檢位點與9個擴大篩查位點的聯合檢驗外，還增加了性染色體倍型檢測位點，一次檢測除了可以檢出AZF微缺失，還可以覆蓋克氏綜合征等性染色體倍型異常病例，大大提高了異常病例檢出率。

目前臨床實驗室多采用AZF區15個STS位點對AZF微缺失進行檢測[10-11]。本研究對傳統檢測位點進行拓展，同時檢測27個遺傳標記，采用復合熒光多重PCR-毛細管電泳DNA片段分析技術，依據片段的有無來確定AZF區是否缺失，依據峰型和相對熒光強度對X染色體和Y染色體的倍型進行判斷。本研究結果顯示，該檢測系統對本研究對象中的克氏綜合征等性染色體數目異常及性反轉均可檢出，對于性染色體大片段結構異常以及性染色體嵌合也有很好的提示作用。該檢測體系運用多重PCR結合毛細管電泳的方法，檢測方法不僅簡單、經濟，而且可靠。但是需要提出的是，由于遺傳標記選擇的數目局限性，如果異常片段不包括本研究所選擇的遺傳標記片段，那么就有漏診的風險；因此在臨床中，對于陰性結果，需要結合患者臨床表型，進而決定是否進行更進一步的檢測，比如染色體核型分析、aCGH檢測及基因檢測等[12]。