LncRNA XIST對(duì)順鉑誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞活力和凋亡的影響

吳 偉，楊耀輝，王亞奇，王艷瑛，唐 強(qiáng)

1)駐馬店市中心醫(yī)院肝膽胰脾外科 河南駐馬店 463000 2)河南省人民醫(yī)院肝膽胰腺外科 鄭州 450003

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma ，HCC)是世界上最常見(jiàn)的實(shí)體腫瘤之一，是世界第三大癌癥死亡原因，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。由于腫瘤轉(zhuǎn)移和對(duì)常規(guī)化療藥物耐藥，HCC易復(fù)發(fā)。深入了解化療耐藥的分子機(jī)制對(duì)于改善HCC預(yù)后至關(guān)重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA，是一種潛在的生物調(diào)控因子，在基因翻譯、基因轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳調(diào)控和RNA轉(zhuǎn)換等諸多領(lǐng)域受到人們的關(guān)注[2]。LncRNA通過(guò)miRNA參與癌細(xì)胞化療耐藥的調(diào)控，如LncRNA MALAT1作為miR-200a海綿，可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和吉非替尼耐藥[3]。LncRNA SDHAP1通過(guò)miR-4465上調(diào)EIF4G2表達(dá)，調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的紫杉醇耐藥[4]。近年來(lái)，LncRNA XIST被報(bào)道在多種組織中發(fā)揮普遍的致癌作用[5-7]。XIST與miR-124相互作用，通過(guò)靶向雄激素受體調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移[8]。XIST通過(guò)let-7i/bag1軸促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑(CDDP)耐藥[9]。本研究中，我們擬探討XIST對(duì)CDDP誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞活力和凋亡能力的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器HepG2細(xì)胞購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾科技公司。點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。CDDP購(gòu)自美國(guó)Selleck公司。XIST-siRNA及其對(duì)照(siRNA-NC)、XIST-pcDNA及其對(duì)照pcDNA-3.1(+)、miR-133a mimic及其對(duì)照(mimic-NC)、miR-133a抑制劑及其對(duì)照(抑制劑NC)質(zhì)粒均由GenePharma公司合成；Turbofect試劑來(lái)自美國(guó)Invitrogen公司。Bax、Bcl-2、Wnt、β-catenin、Caspase-3、Caspase-9抗體和GAPDH多克隆抗體購(gòu)自上海圣克魯斯生物公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購(gòu)自上海碧云天生物有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量RCR試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1，由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。

表1 引物序列

1.2 XIST與miR-133a靶向關(guān)系的驗(yàn)證采用miRanda預(yù)測(cè)XIST潛在的靶基因。通過(guò)分子克隆方法構(gòu)建野生型(wt)XIST載體，再通過(guò)點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建突變型(mut)XIST載體。將稀釋后的HepG2細(xì)胞接種于12孔板，細(xì)胞融合至70%～75%時(shí)，利用Turbofect試劑將XIST-wt、XIST-mut載體分別與miR-133a mimic、mimic-NC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，48 h后，采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.3 CDDP作用條件的篩選HepG2細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，及時(shí)更換培養(yǎng)基并進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞分別用0、5、10 μmol/L的CDDP處理48 h后收集，采用CCK-8試劑盒分析細(xì)胞活力。細(xì)胞用10 μmol/L的CDDP分別處理0、24、48 h后收集，CCK-8法分析細(xì)胞活力。

1.4 下調(diào)XIST表達(dá)對(duì)CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞活力和凋亡的影響

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組 將HepG2細(xì)胞用10 μmol/L的CDDP處理48 h后，分兩組，分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC、XIST-siRNA，按照Turbofect試劑說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.2細(xì)胞活力的測(cè)定 轉(zhuǎn)染48 h后，棄上清，收集細(xì)胞，PBS洗3次，添加10 μL CCK-8工作液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光度(反映細(xì)胞活力)。重復(fù)3次。

1.4.3細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白和Wnt/β-catenin通路蛋白的檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后，裂解液充分裂解細(xì)胞，提取總蛋白，按照75 V 30 min、120 V 1.5 h的程序進(jìn)行SDS-PAGE，每孔上樣50 μg。電泳結(jié)束后利用濕轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶液室溫封閉3 h，加Bax(1∶5 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶5 000)、Caspase-9(1∶5 000)、Wnt(1∶10 000)、β-catenin(1∶5 000)一抗室溫孵育2 h，洗膜液清洗5 min×4次，加入稀釋好的二抗(山羊抗兔IgG 1∶4 000，山羊抗鼠IgG 1∶5 000)室溫?fù)u床孵育1.5 h，TBST洗5 min×5次，滴加發(fā)光液曝光。使用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。重復(fù)3次。

1.4.4細(xì)胞中XIST表達(dá)水平的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度。總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。預(yù)變性95 ℃10 min；變性95 ℃10 s，退火60 ℃20 s，延伸72 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算XIST表達(dá)水平。重復(fù)3次。

1.5 下調(diào)miR-133a表達(dá)對(duì)CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞活力和凋亡的影響將HepG2細(xì)胞用10 μmol/L的CDDP處理48 h后，分兩組，按照Turbofect試劑說(shuō)明書(shū)操作，分別轉(zhuǎn)染miR-133a抑制劑及抑制劑NC。48 h后進(jìn)行細(xì)胞活力、凋亡相關(guān)蛋白及Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)水平，以及miR-133a表達(dá)水平的檢測(cè)，方法同前。重復(fù)3次。

1.6 上調(diào)XIST和miR-133a表達(dá)對(duì)CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞活力和凋亡的影響將HepG2細(xì)胞用10 μmol/L的CDDP處理48 h后，分別轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)+mimic-NC、pcDNA-XIST+mimic-NC、pcDNA-XIST+miR-133a mimic，按照Turbofect試劑說(shuō)明書(shū)操作。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行細(xì)胞活力、凋亡相關(guān)蛋白及Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)水平、XIST和miR-133a表達(dá)水平的檢測(cè)，方法同前，重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間各指標(biāo)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；3組間細(xì)胞活力、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，XIST、miR-133a表達(dá)水平及Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 XIST和miR-133a靶向關(guān)系的驗(yàn)證miRanda預(yù)測(cè)XIST和miR-133a有結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，XIST-wt和miR-133a mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性降低，而XIST-mut與miR-133a mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)明顯變化，提示兩者存在靶向關(guān)系。

圖1 XIST與miR-133a結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.2 CDDP作用條件的篩選由表3和表4可以看出，10 μmol/L的CDDP處理48 h后HepG2細(xì)胞活力降低，后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定為10 μmol/L的CDDP處理HepG2細(xì)胞48 h。

表3 不同濃度CDDP處理48 h后HepG2細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果

表4 10 μmol/L的CDDP處理不同時(shí)間后HepG2細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果

2.3 下調(diào)XIST后CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞活力和凋亡能力的變化見(jiàn)表5。與siRNA-NC組比較，XIST-siRNA組Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高；Caspase-3、Caspase-9、Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)降低；細(xì)胞活力升高(P<0.05)。提示下調(diào)XIST表達(dá)可以提高CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的活力，抑制凋亡，并抑制Wnt/β-catenin通路激活。

表5 siRNA-NC和XIST-siRNA組細(xì)胞活力、凋亡相關(guān)蛋白、Wnt/β-catenin通路蛋白和XIST表達(dá)水平的比較(n=3)

2.4 下調(diào)miR-133a后CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞活力和凋亡能力的變化見(jiàn)表6。與抑制劑NC組比較，miR-133a抑制劑組Bax蛋白表達(dá)上升，Bcl-2蛋白表達(dá)下降；Caspase-3、Caspase-9、Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)升高；細(xì)胞活力降低(P<0.05)。提示下調(diào)miR-133a表達(dá)可以降低CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的活力，促進(jìn)凋亡，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

表6 抑制劑NC組和miR-133a抑制劑組細(xì)胞活力、凋亡相關(guān)蛋白、Wnt/β-catenin通路蛋白和miR-133a表達(dá)水平的比較(n=3)

2.5 同時(shí)上調(diào)XIST和miR-133a后CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞活力和凋亡能力的變化見(jiàn)表7。與pcDNA-3.1(+)+mimic-NC組相比，pcDNA-XIST+mimic-NC組Bax、Caspase-3和Caspase-9、Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞活力升高(P<0.05)。與pcDNA-XIST+mimic-NC組相比，pcDNA-XIST+miR-133a mimic組Bax、Caspase-3、Caspase-9、Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞活力降低；與pcDNA-3.1(+)+mimic-NC組比較，細(xì)胞活力、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。

表7 3組細(xì)胞活力、XIST、miR-133a、凋亡相關(guān)蛋白、Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

3 討論

LncRNA與人類(lèi)腫瘤關(guān)系密切，在腫瘤發(fā)生和化療耐藥過(guò)程中起重要作用[10]。越來(lái)越多的研究[11-13]表明LncRNA通過(guò)靶向miRNA發(fā)揮對(duì)腫瘤的調(diào)控作用。LncRNA XIST作為miR-101的分子海綿，可以通過(guò)調(diào)節(jié)EZH2的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)胃癌進(jìn)展[14]。本研究利用生物信息學(xué)軟件miRanda預(yù)測(cè)到XIST和miR-133a有結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)XIST與miR-133a存在靶向關(guān)系。miR-133a在癌癥進(jìn)程中和化療耐藥中發(fā)揮重要作用。在膀胱癌中，miR-133a靶向TAGLN2發(fā)揮抑癌作用[15]。miR-133a低表達(dá)是食管鱗癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子[16]。在結(jié)直腸癌中，miR-133a也發(fā)揮了明顯的抑癌作用。

本研究對(duì)XIST在肝癌HepG2細(xì)胞CDDP耐藥過(guò)程中的作用和可能的機(jī)制進(jìn)行了分析。我們發(fā)現(xiàn)10 μmol/L的CDDP處理48 h后HepG2細(xì)胞活力降低，因此將實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定為10 μmol/L的CDDP處理HepG2細(xì)胞48 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用siRNA下調(diào)XIST表達(dá)后，CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9和通道蛋白Wnt、β-catenin表達(dá)降低，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)和細(xì)胞活力升高，提示下調(diào)XIST表達(dá)能夠抑制CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡；利用抑制劑下調(diào)miR-133a表達(dá)后，CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞Bax、Caspase-3、Caspase-9和Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)和細(xì)胞活力降低，提示下調(diào)miR-133a表達(dá)能夠促進(jìn)CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡。與未調(diào)節(jié)的對(duì)照組比較，同時(shí)上調(diào)XIST和miR-133a表達(dá)后，CDDP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力未發(fā)生明顯變化。研究結(jié)果提示XIST可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-133a-Wnt/β-catenin軸，從而影響HepG2細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性，但具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，XIST可能通過(guò)miR-133a-Wnt/β-catenin軸調(diào)控CDDP誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。XIST有可能成為肝癌治療的靶點(diǎn)。