胚胎凍存時間對凍胚周期臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局的影響

劉艷麗，申峻涵，張玉超，王興玲，武文斌，杜姍姍，胡繼君，管一春

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052

在輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)中，胚胎冷凍保存已成為臨床常規(guī)工作。它不僅降低了卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生，提高ART治療的安全性，還有利于提高單個取卵周期的胚胎利用率和累積妊娠率，降低治療費用[1]。此外，對于因病情需卵巢切除或進(jìn)行放化療且有生育要求的已婚患者，治療前凍存胚胎可有效保存生育力。但胚胎發(fā)育潛能和臨床結(jié)局是否受到冷凍保存時長的影響成為廣大醫(yī)務(wù)人員和患者關(guān)注的焦點問題，且目前的文獻(xiàn)報道[2-6]并無一致結(jié)論。為此，本文分析了胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后保存時間對臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2016年1月1日至 2019年9月30日在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行凍融胚胎移植病例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡≤37歲。②移植周期≤3次。排除標(biāo)準(zhǔn)：①胚胎植入前接受遺傳學(xué)診斷/胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic diagnosis/screening，PGD/PGS)者。②復(fù)蘇后無可利用胚胎者。③供卵患者。④序貫移植者。⑤移植胚胎的冷凍時間不一致者。

1.2 胚胎冷凍方案的制定接受體外受精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)(invitrofertilization and embryo transfer，IVF-ET)的患者取卵后第3天到院被告知胚胎情況，臨床醫(yī)師和胚胎學(xué)家根據(jù)患者自身情況和胚胎情況，個性化制定冷凍方案。直接冷凍保存第3天胚胎(D3胚胎)或者繼續(xù)培養(yǎng)2～4 d形成囊胚后冷凍保存。D3胚胎冷凍標(biāo)準(zhǔn)是每管≤2個胚胎；囊胚的冷凍標(biāo)準(zhǔn)為前3管每管1個囊胚，第4管及以后每管2個囊胚。患者簽署胚胎冷凍保存知情同意書。

1.3 胚胎冷凍及復(fù)蘇

1.3.1卵裂期胚胎冷凍標(biāo)準(zhǔn) 胚胎發(fā)育的第3天，選擇4細(xì)胞及以上的Ⅰ～Ⅲ級[7]可利用卵裂期胚胎進(jìn)行冷凍，其中Ⅰ級和Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.3.2囊胚的冷凍標(biāo)準(zhǔn) 胚胎發(fā)育的第5至第7天，選擇級別為3BC以上的囊胚[8]進(jìn)行冷凍，其中3BB及以上的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚，囊胚冷凍前進(jìn)行激光皺縮。

1.3.3冷凍方法 使用的冷凍液和解凍液均購自日本加藤公司。冷凍液在室溫下平衡至少30 min，將胚胎置于玻璃化冷凍平衡液中平衡10 min，待細(xì)胞內(nèi)水分和冷凍保護(hù)劑充分置換后，轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液中平衡，1 min內(nèi)移至冷凍載桿上并迅速投入液氮中保存。冷凍操作均在室溫下進(jìn)行。

1.3.4復(fù)蘇方法 移植當(dāng)日復(fù)蘇胚胎。將復(fù)蘇液1在37 ℃培養(yǎng)箱中平衡30 min，復(fù)蘇液2、3、4在室溫下平衡30 min。復(fù)蘇時，將載桿尖端迅速投入復(fù)蘇液1中，約1 min后將胚胎依次轉(zhuǎn)入復(fù)蘇液2、3、4中各停留3 min，然后轉(zhuǎn)入G-2培養(yǎng)皿中。復(fù)蘇操作第一步在37 ℃工作臺上進(jìn)行。

1.3.5胚胎復(fù)蘇成功的標(biāo)準(zhǔn) 卵裂期胚胎至少一半卵裂球存活，囊胚復(fù)蘇2 h后囊胚腔擴(kuò)張為復(fù)蘇成功。復(fù)蘇后至少培養(yǎng)2 h后再移植。所有凍融胚胎移植前均行激光輔助孵化。

1.4 內(nèi)膜準(zhǔn)備對于月經(jīng)規(guī)律、排卵正常的患者，采用自然周期準(zhǔn)備內(nèi)膜；對于月經(jīng)不規(guī)律或無排卵、月經(jīng)不調(diào)、多囊卵巢綜合征及黃體功能不全的患者，采用激素替代周期準(zhǔn)備內(nèi)膜；對于月經(jīng)周期長、排卵障礙、多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜厚及有雌激素應(yīng)用禁忌證的患者，采用刺激周期準(zhǔn)備內(nèi)膜。

1.5 隨訪胚胎移植后第14天進(jìn)行血清β-HCG水平測定；對于血清β-HCG陽性(≥50 IU/L)的患者，于移植后第35天陰超檢測孕囊。后期進(jìn)一步隨訪異位妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率、新生兒出生孕周、出生體重、性別比及出生缺陷等指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 患者的基本資料本研究共納入8 338個凍胚周期，根據(jù)胚胎凍存時間(<4個月，4～個月，7～個月，13～個月，25～個月和≥37個月)分為6組，記為第1～6組，6組基本資料詳見表1。由表1可知，胚胎移植時女方年齡均隨保存時間延長而增加(P<0.001)；各組間女方BMI和內(nèi)膜厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，原發(fā)性不孕癥占比隨保存時間的延長而降低。不孕的主要原因是輸卵管性不孕，其次是男性不育；凍胚移植周期中囊胚移植占很大比例，且以單囊胚移植為主，卵裂期胚胎以移植兩枚D3胚胎為主。

表1 6組的基本資料

2.2 6組臨床結(jié)局的比較6組凍融胚胎的復(fù)蘇率、血HCG陽性率、臨床妊娠率、早期胚胎丟失率和異位妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各組之間種植率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率和雙胎率之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但校正女方年齡、BMI、周期數(shù)、移植胚胎階段、移植胚胎數(shù)量和優(yōu)胚數(shù)量、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案等潛在混雜因素后發(fā)現(xiàn)，除了第6組和第1組的種植率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034)外，其余各組之間的流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率和雙胎率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2、3。

表2 6組臨床結(jié)局的比較 %

2.3 胚胎不同凍存時間的新生兒結(jié)局見表4。由表4可知，移植不同凍存時間的胚胎活產(chǎn)嬰兒中，各組之間早產(chǎn)兒占比、男嬰占比、低體重兒占比，分娩孕周、身長和出生體重及出生缺陷占比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 不同凍存時間胚胎移植臨床結(jié)局的優(yōu)勢比*

表4 不同凍存時間胚胎移植的新生兒結(jié)局

續(xù)表4

3 討論

自1983年人類首例凍融胚胎移植獲得妊娠并活產(chǎn)后[9]，玻璃化冷凍胚胎技術(shù)作為一項常規(guī)且成熟的技術(shù)應(yīng)用于臨床已40余年。隨著凍存時間延長，玻璃化胚胎長期低溫保存的安全性已成為輔助生殖醫(yī)生關(guān)注的焦點問題。理論上，在-196 ℃液氮中，胚胎的代謝受到抑制，原則上可長期保存。Machtinger等[10]生物學(xué)家推測哺乳動物胚胎在液氮中凍存幾千年，細(xì)胞仍然可以存活；Dowling-Lacey等[11]報道了冷凍保存時間最長的臨床妊娠案例(凍存20 a的供卵體外受精形成的胚胎進(jìn)行復(fù)蘇移植并活產(chǎn))。

但也有研究[12]認(rèn)為玻璃化冷凍雖能使細(xì)胞及細(xì)胞外環(huán)境固化為“玻璃狀”，大分子擴(kuò)散遷移率受到限制，但根據(jù)低溫生物學(xué)原理，分子局部小運動仍可在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)附近或Tg以下流動；也有學(xué)者[13]認(rèn)為胚胎在低溫凍存過程中，與低溫保護(hù)劑相關(guān)的自由基及其毒性作用可能導(dǎo)致胚胎DNA片段增加；再者，除了冷凍保護(hù)劑的毒性作用，胚胎在凍存過程中可能受到宇宙背景的影響而改變等。中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會胚胎冷凍保存時限的中國專家共識建議胚胎冷凍保存時間不超過10 a，認(rèn)為胚胎冷凍時間過長可能對胚胎的潛能造成一定影響[14]。因此，本研究分析了延長胚胎凍存時間是否對凍胚移植的臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局造成不良影響。

根據(jù)2018年《胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查專家共識》[15]中將女方年齡≥38歲或3次移植種植失敗定為符合胚胎植入前篩查的條件(可能存在胚胎染色體異常率較高、反復(fù)著床失敗等)，本研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)為女方年齡≤37歲，移植周期≤3次，排除高齡和多周期患者對移植結(jié)局產(chǎn)生的偏移和干擾，這樣的納入標(biāo)準(zhǔn)是為了在預(yù)后相對較好的人群中探討冷凍保存時間對凍融胚胎移植后臨床結(jié)局的影響。本研究的基本資料中，各組間女方年齡差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且隨著凍存時間增加而呈增加趨勢，可能與分組較多且納入樣本量較大有關(guān)；男方年齡與女方年齡保持相同的趨勢。原發(fā)不孕的占比隨著凍存時間增加而降低，其原因可能是原發(fā)不孕患者一般會在半年內(nèi)進(jìn)行胚胎移植，更迫切獲得妊娠；繼發(fā)不孕患者多有生育史，二胎生育占比較高，所以凍存時間相對于原發(fā)不孕較長。

在本研究中，隨著胚胎凍存時間的延長，冷凍胚胎的復(fù)蘇率并非呈下降趨勢，且凍存時間≥37個月組的復(fù)蘇率(99.2%)在各組中最高，說明了凍存時間延長不影響胚胎的完整性；胚胎種植率能進(jìn)一步說明胚胎的活性和發(fā)育潛能，凍存時間在25～個月組和≥37個月組的種植率(48.4%vs54.6%)都稍高于其他各組，可能與基本資料所顯示的后兩組所移植的胚胎中囊胚占比較高有一定的關(guān)系(72.2%vs66.7%)，課題組之前的數(shù)據(jù)[16]也說明了囊胚有更高的種植率和臨床妊娠率，所以后兩組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率也表現(xiàn)了相似的趨勢。校正了混雜因素以后，發(fā)現(xiàn)凍存時間≥37個月組的種植率明顯高于<4個月組的種植率，進(jìn)一步證實了凍存時間不會對胚胎的活力和潛能造成不良影響。同時分析患者病史和病因，發(fā)現(xiàn)≥37個月組男方因素和輸卵管因素占比較高，病因較為明確，而體外受精恰恰能解決這一問題，這也可能是≥37個月組胚胎種植率較高的一個重要原因。

為了更準(zhǔn)確說明凍存時間延長與臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局的關(guān)系，在校正了潛在混雜因素后，發(fā)現(xiàn)不同凍存時間組臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。查閱國內(nèi)外關(guān)于凍存時間與臨床結(jié)局的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)結(jié)論也不一致：Testart等[17]研究結(jié)果顯示人類胚胎經(jīng)過幾個月冷凍保存后，胚胎存活率和妊娠率降低，但此研究未控制冷凍前胚胎的狀態(tài)；Ryan等[18]在IVF患者和供卵患者的研究中發(fā)現(xiàn)原核期或卵裂期胚胎經(jīng)過不同時間的凍存后臨床結(jié)局均不受影響；Liu等[19]和Yuan等[20]報道胚胎凍存時間不影響復(fù)蘇率和臨床結(jié)局，但這3項研究為程序化冷凍法。關(guān)于玻璃化凍存時間對臨床結(jié)局的影響有如下報道：Wirleitner等[21]回顧性分析603個周期玻璃化冷凍囊胚保存6 a，對胚胎存活率、植入率和新生兒預(yù)后均無負(fù)面的影響，但其局限性是樣本量小；Ueno等[22]學(xué)者研究35～39歲人群且診斷為輸卵管因素不孕癥和既往移植周期失敗的患者顯示，玻璃化囊胚的低溫保存時間與妊娠和新生兒結(jié)局亦無顯著關(guān)系，因納入標(biāo)準(zhǔn)問題，Ueno的結(jié)論適用于高齡患者，用于其他患者可能存在選擇偏差；Li等[2]的研究顯示胚胎的冷凍保存時間和臨床結(jié)局呈負(fù)相關(guān)，但最長保存時間為24個月，對胚胎凍存時間≥24個月的患者胚胎冷凍保存無法準(zhǔn)確評估。

隨著玻璃化冷凍技術(shù)的廣泛應(yīng)用，有越來越多玻璃化冷凍胚胎的新生兒出生。本研究發(fā)現(xiàn)移植不同凍存時間的胚胎，不會影響新生兒結(jié)局，包括分娩孕周、早產(chǎn)兒占比、性別比、出生體重和身長、低體重兒占比及出生缺陷占比。眾所周知，出生體重是評價圍生期結(jié)局的常用指標(biāo)，低體重與新生兒死亡率相關(guān)。本研究中單胎和雙胎新生兒的出生體重和低體重兒占比均不受胚胎凍存時間的影響。其他學(xué)者的研究亦顯示了相似的結(jié)果：Liu等[19]研究顯示程序化冷凍的卵裂期胚胎移植后子代出生孕周、單胎體重和低體重兒占比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；Li等[23]分析了玻璃化冷凍的卵裂期胚胎不同保存時間的男女出生比例、孕周和單胎出生體重等新生兒結(jié)局差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；Li等[2]研究結(jié)果顯示，在2 a的凍存時間內(nèi)，延長凍存時間后新生兒體重和出生缺陷率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

查閱文獻(xiàn)，胚胎凍存時間對臨床結(jié)局影響的研究相對較少，關(guān)于新生兒結(jié)局的研究更為有限，且未發(fā)現(xiàn)在預(yù)后較好人群中研究玻璃化凍存時間對胚胎活力、臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局的影響。本研究納入女方年齡≤37歲，移植周期≤3次人群，發(fā)現(xiàn)凍存時間延長不會對臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局產(chǎn)生負(fù)面影響，可以幫助臨床醫(yī)生在進(jìn)行凍胚選擇時，不用再擔(dān)心凍存時間對其造成不良影響；但不同凍存時間胚胎出生新生兒的生理和心理健康，需要更長期隨訪。因此，凍融胚胎的遠(yuǎn)期安全性還需更長時間的醫(yī)學(xué)觀察和相關(guān)研究加以佐證。