角質細胞生長因子-2在金黃色葡萄球菌所致肺部感染中的作用及機制研究

樊 宇，張軼博

(錦州醫科大學基礎醫學院病原生物教研室，遼寧 錦州 121017)

肺部感染是細菌、病毒和真菌等病原微生物所致肺部組織出現炎癥病理性改變，患者可出現發熱、咳嗽等臨床癥狀[1]。肺部感染在各個年齡階段皆可發病，其中大型術后、糖尿病、長時間使用呼吸機人群出現肺部感染的概率較高[2]。雖然肺部感染屬于臨床常見疾病之一，但其除感染外，還會誘發多種并發癥，影響機體功能的恢復，因此一旦出現肺部感染，需要及時送醫治療。肺部感染因其致病因素的不同可以分為細菌性、病毒性、真菌性、非典型病原體等肺部感染，其中細菌性肺部感染占比最高[3]。金黃色葡萄球菌是革蘭陽性菌，可誘發感染，發生敗血癥[4]、菌血癥[5]、心膜炎[6]和肺炎[7]等。隨著甲氧西林耐藥株的增多，金黃色葡萄球菌所致感染的治療難度增加。金黃色葡萄球菌所致感染動物模型也常用于其作用機制研究。角質細胞生長因子-2(Keratinocyte growth factor-2，KGF-2)也稱為成纖維細胞生長因子10，可介導上皮間充質細胞的相互作用，在肺組織發育過程中發揮重要作用。研究[8]表明，可以通過KGF-2介導的細胞增殖和炎癥反應來改善糖尿病潰瘍患者的傷口愈合情況，但是KGF-2在金黃色葡萄球菌所致肺部感染中的作用機制尚不明確，故本研究通過動物模型初步探討其在金黃色葡萄球菌所致肺部感染中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：6～8周齡清潔級BALB/c小鼠80只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2019-0009。購回后適應性飼養1周，飼養環境為清潔級，實驗遵循3R原則。

1.1.2 主要試劑和儀器：KGF-2(批號：2009111)購自北京百奧萊博科技有限公司；金黃色葡萄球菌菌株由中國醫學科學院生物技術研究所提供；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、巨噬細胞炎性蛋白-2(MIP-2)、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(批號依次為1910125、1911104、1905106、1912064、1911162、1908241、1908211)購自上海茁彩生物科技有限公司。多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司；Echo Revolve熒光顯微鏡購自美國ECHO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與干預：將小鼠分為五組，每組16只，分別為對照組、細菌組、KGF-2低劑量組(2.5 mg/kg)、KGF-2中劑量組(5 mg/kg)和KGF-2高劑量組(10 mg/kg)。對照組經鼻滴入等體積的磷酸緩沖液100 μl，其余各組小鼠均經鼻滴入金黃色葡萄球菌(2×108CFU/ml)100 μl。距離滴入金黃色葡萄球菌懸液1 h后，KGF-2低劑量組、KGF-2中劑量組和KGF-2高劑量組小鼠分別經尾靜脈注射2.5、5、10 mg/kg的KGF-2，細菌組和對照組小鼠經尾靜脈注射等體積0.9%氯化鈉溶液。距離首次滴入細菌懸液24 h后取樣進行指標檢測。

1.2.2 肺組織病理觀察：麻醉處死一部分小鼠，快速取肺。一部分肺組織固定于4%甲醛中性溶液中，經傳統石蠟包埋、切片、脫蠟、復水、蘇木素-伊紅染色、脫水、透明、中性樹脂封片后，顯微鏡下觀察肺組織病理結構變化。另一部分肺組織進行濕/干質量比測定。

1.2.3 肺泡灌洗液炎性因子和氧化應激因子水平檢測：將分離得到的肺進行支氣管肺泡灌洗。一部分灌洗液用于檢測中性粒細胞和白細胞水平。另一部分灌洗液以3500 r/min離心10 min，取上清液檢測TNF-α、IL-6、IL-1β、MPO、MDA、MIP-2和T-AOC水平。

1.2.4 肺泡巨噬細胞吞噬功能檢測：使用半體法檢測小鼠肺泡巨噬細胞的吞噬功能。距離滴入細菌懸液24 h的前30 min時，各組小鼠給予3%雞紅細胞懸液200 μl，30 min后處死小鼠，分離肺組織并進行支氣管肺泡灌洗，回收灌洗液并將其滴于玻片上，37 ℃孵育40 min，去除未貼壁細胞后使用甲醇/丙酮固定，吉姆薩染色15 min，純水漂洗、晾干，在油鏡下統計巨噬細胞200個，以及其中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞個數、被吞噬雞紅細胞個數。吞噬百分比=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞個數/200×100%。吞噬指數=被吞噬雞紅細胞個數/200。

2 結 果

2.1 各組小鼠肺組織病理情況比較 見圖1。對照組小鼠肺泡排列完整且無組織損傷，細菌組小鼠肺泡有炎性浸潤和水腫，KGF-2不同劑量組小鼠肺組織炎性浸潤和水腫情況得到明顯改善。

2.2 各組小鼠肺組織濕/干質量比和肺泡灌洗液中性粒細胞、白細胞水平比較 見表1。細菌組肺濕/干質量比和肺泡灌洗液中性粒細胞、白細胞水平高于對照組，而KGF-2不同劑量組肺濕/干質量比和肺泡灌洗液中性粒細胞、白細胞水平低于細菌組(均P<0.05)。

A：對照組；B：細菌組；C：KGF-2低劑量組；D：KGF-2中劑量組；E：KGF-2高劑量組

表1 各組小鼠肺組織濕/干質量比和肺泡灌洗液中性粒細胞、白細胞水平比較

2.3 各組小鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平比較 見表2。細菌組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于對照組(均P<0.05)。KGF-2不同劑量組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平低于細菌組(均P<0.05)。

2.4 各組小鼠肺泡灌洗液中氧化應激因子水平比較 見表3。細菌組肺泡灌洗液中MPO、MDA水平高于對照組，T-AOC水平低于對照組(均P<0.05)。KGF-2不同劑量組肺泡灌洗液中MPO、MDA水平低于細菌組，T-AOC水平高于細菌組(均P<0.05)。

2.5 各組小鼠MIP-2水平和肺泡巨噬細胞功能比較 見表4。細菌組肺泡灌洗液中MIP-2水平高于對照組，肺泡巨噬細胞吞噬百分比和吞噬指數低于對照組(均P<0.05)。KGF-2不同劑量組肺泡灌洗液中MIP-2水平低于細菌組，肺泡巨噬細胞吞噬百分比和吞噬指數高于細菌組(均P<0.05)。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平比較(pg/ml)

表3 各組小鼠肺泡灌洗液中氧化應激因子水平比較

表4 各組小鼠MIP-2水平和肺泡巨噬細胞功能比較

3 討 論

肺部感染是臨床常見感染性疾病之一，直接影響機體呼吸道功能，重度感染可引起呼吸衰竭甚至死亡。引起肺部感染因素眾多，細菌致病性感染是其主要原因[9]。金黃色葡萄球菌是醫院感染和社區獲得性感染常見致病菌之一，在人體皮膚和黏膜組織中廣泛分布，可以引起多種部位感染，其細胞壁含有的肽聚糖、磷脂壁酸為主要抗原成分[10]。金黃色葡萄球菌還可產生毒素因子(細胞表面抗原、酶和毒素)，其產生的毒素對宿主細胞具有降解作用，使宿主反應降低，還可調節機體免疫反應，影響宿主的抗感染能力[11]。金黃色葡萄球菌侵染宿主細胞主要涉及細胞黏附、侵染過程，在宿主細胞內化后可在細胞內存活[12]。本研究通過金黃色葡萄球菌感染模擬臨床肺部感染，發現金黃色葡萄球菌感染所致肺部感染小鼠肺組織呈現出明顯炎性浸潤和水腫，說明金黃色葡萄球菌感染可以引起肺部組織損傷。金黃色葡萄球菌侵染機體后，其表面抗原可被Toll樣受體(TLR)2識別，并激活下游磷酸分子，再通過一系列級聯反應激活核因子(NF)-κB信號通路，增從而強炎癥反應[13]。

KGF-2是成纖維細胞因子家族成員之一，是由208個氨基酸組成的多肽，主要由基質細胞表達和分泌[14]。KGF-2被釋放后，可以通過高親和力與成纖維細胞生長因子(FGF)受體2Ⅲb、1Ⅲb結合，這些受體在上皮和內皮細胞表面分布廣泛。由于KGF-2的結構和生物學功能與KGF十分相似，因此KGF-2也具有充當旁分泌介質并促進上皮細胞增殖/分化、血管生成和毛細血管單層屏障功能，還可加速切口愈合，減輕腸道黏膜損傷和修復腸道黏膜屏障[15]。本研究在金黃色葡萄球菌感染小鼠后給予KGF-2干預，結果發現KGF-2可以明顯改善肺部感染小鼠肺組織炎性浸潤和組織水腫情況，同時還可以部分逆轉金黃色葡萄球菌感染所致小鼠肺泡灌洗液中肺濕/干質量比、中性粒細胞和白細胞水平升高趨勢，此結果與文獻[16]結果趨勢一致，說明KGF-2干預可以降低金黃色葡萄球菌感染所致的肺部損傷。

中性粒細胞具有很強的變形游走能力和吞噬活性，能夠吞噬病原菌和異物，可在炎癥趨化因子的作用下聚集在炎癥部位，可作為炎癥早期反應的檢測指標[17]。本研究結果顯示金黃色葡萄球菌所致肺部感染小鼠肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-6、IL-1β、MPO和MDA水平明顯升高，T-AOC水平降低，給予KGF-2可以逆轉上述趨勢。TNF-α、IL-6、IL-1β均為促炎因子，是常用的炎癥反應指標之一。MPO是由中性粒細胞嗜天青顆粒釋放的一種過氧化物酶，中性粒細胞活化后可促進MPO釋放，其水平可以反映機體炎癥反應和氧化應激情況[18]。MDA屬于脂質過氧化產物，能夠反映氧化應激損傷程度。T-AOC是可以體現機體抗氧化能力的指標之一，其水平降低表明機體抗氧化能力減弱[19]。本研究結果說明，KGF-2可以降低肺部感染小鼠肺部炎癥反應，提高抗氧化應激能力。

巨噬細胞在機體的天然免疫系統中具有重要作用，在不同組織環境中可產生不同的分化和功能。肺泡巨噬細胞是肺組織主要巨噬細胞類型之一[20]。本研究結果顯示，KGF-2可以降低肺泡灌洗液中MIP-2水平并提高泡巨噬細胞的吞噬百分比和吞噬指數。肺泡巨噬細胞不僅具有吞噬功能，還具有炎性因子分泌作用。MIP-2是能夠誘導炎癥級聯反應活化的炎癥趨化因子，可由肺泡巨噬細胞和呼吸道上皮細胞分泌產生，能夠作用于中性粒細胞[21]。本研究結果說明，KGF-2可能通過抑制肺泡巨噬細胞的促炎功能來改善肺部感染小鼠的肺部炎癥反應。

綜上所述，KGF-2可以改善金黃色葡萄球菌所致肺部感染損傷，降低肺炎癥反應，提高抗氧化應激能力，其作用機制可能與影響肺泡巨噬細胞功能有關，但其中的具體分子機制還需要深入研究。