線粒體動態(tài)蛋白在卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義

高 燕，楊 紅，劉淑娟，葛俊麗，賀艷麗，張紅菊，張曉紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032)

卵巢癌為女性生殖系統(tǒng)腫瘤中病死率較高的惡性腫瘤，其早期確診率較低，多數(shù)患者確診時已至晚期，明顯增加了治療難度。雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，卵巢癌患者的預(yù)后有所改善，但是由于卵巢癌轉(zhuǎn)移率居高不下，患者預(yù)后往往不佳。目前臨床中主要通過影像學(xué)和癌胚抗原125檢測等方法對卵巢癌進(jìn)行診斷，但是在早期診斷中的應(yīng)用價值較低，且對患者預(yù)后評估的價值有限[1]。探索新型靈敏的生物標(biāo)志物對促進(jìn)卵巢癌的早期篩查、病情及預(yù)后評估具有積極的臨床意義。線粒體功能正常是保證細(xì)胞生理活動正常進(jìn)行的基礎(chǔ)。目前認(rèn)為線粒體主要通過分裂與融合參與細(xì)胞凋亡、能量代謝等調(diào)控過程，而線粒體分裂活性異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均相關(guān)[2]。線粒體動態(tài)蛋白(Mitochondrial dynamic protein of 51 kDa，MiD51)在線粒體分裂調(diào)控中起重要作用，研究[3]發(fā)現(xiàn)肺癌組織中MiD51表達(dá)上調(diào)，并可有助于肺癌細(xì)胞增殖，下調(diào)MiD51則可促使肺癌細(xì)胞凋亡。但是目前關(guān)于MiD51在卵巢癌中表達(dá)情況尚未明確，因此本研究以卵巢癌患者為研究對象，觀察MiD51在卵巢癌中的表達(dá)，并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1-12月我院收治的行手術(shù)治療的卵巢癌患者80例作為卵巢癌組，其中年齡37～72歲，平均(54.82±10.20)歲；漿液性腺癌52例，非漿液性腺癌28例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期中，Ⅱ期23例，Ⅲ期31例，Ⅳ期26例；低分化38例，中高分化42例；腫瘤直徑2～8 cm，平均(5.05±1.58)cm。選取同期因子宮內(nèi)膜癌等疾病切除卵巢的患者40例作為對照組，年齡36～70歲，平均(54.24±9.01)歲。兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：卵巢癌組均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為卵巢癌，術(shù)前未行放化療、激素等相關(guān)治療；對照組卵巢組織中未見腫瘤細(xì)胞；患者資料完整，研究知情同意并接受隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴其他惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、肝腎等臟器功能明顯不全、感染性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員后批準(zhǔn)后開展。

1.2 研究方法

1.2.1 MiD51表達(dá)檢測：使用免疫組化SP法測量兩組卵巢組織中MiD51表達(dá)。將兩組石蠟標(biāo)本切成厚度為4 μm的切片，脫蠟、梯度乙醇脫水、H2O2處理后孵育10 min。行抗原修復(fù)、封閉后加入兔抗人MiD51抗體(批號：ab89944；英國Abcam公司)，稀釋比設(shè)置為1∶300，4 ℃下孵育過夜。滴加二抗，37 ℃下孵育30 min，依次顯色、復(fù)染、脫水、封片，置于400倍顯微鏡下觀察。其中陽性對照為已知MiD51陽性切片，陰性對照為PBS。

1.2.2 結(jié)果判斷[4]：MiD51主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見棕褐色顆粒。由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對結(jié)果進(jìn)行判讀：每張切片中隨機(jī)選擇10個視野，根據(jù)陽性細(xì)胞占比與著色情況之和計分。其中，陽性細(xì)胞占比≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，75%以上為4分；未見著色為0分，著淺黃色為1分，著棕黃色為2分，著棕褐色為3分?？偡帧?分視為陰性，≥2分視為陽性。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較兩組卵巢組織中MiD51的表達(dá)情況。②比較不同臨床特征卵巢癌患者M(jìn)iD51表達(dá)情況，分析MiD51表達(dá)與卵巢癌患者臨床特征的相關(guān)性。臨床特征包括年齡、絕經(jīng)、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化類型、FIGO分期、腫瘤直徑、腹水、肌層浸潤深度，其中年齡、腫瘤直徑均根據(jù)平均值確定臨界值(55歲和5 cm)。③對卵巢癌患者進(jìn)行電話或門診隨訪，比較MiD51陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的總生存期(OS)和無進(jìn)展生存期(PFS)。隨訪終止事件為患者死亡或至隨訪終止時間(2021年4月)。本研究中，OS為患者手術(shù)到末次隨訪或死亡的時間，PFS為患者手術(shù)至疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的時間。④比較不同臨床特征卵巢癌患者3年生存率，將可能影響卵巢癌患者生存的因素納入COX回歸中，分析影響卵巢癌患者生存的危險因素。臨床特征包括年齡、絕經(jīng)、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化類型、FIGO分期、腫瘤直徑、腹水、肌層浸潤深度、殘留病灶直徑、化療療程、MiD51陽性。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者卵巢組織中MiD51表達(dá)情況比較 見圖1。卵巢癌組MiD51陽性表達(dá)率為61.25%(49/80)，對照組MiD51表達(dá)陽性率為17.5%(7/40)，卵巢癌組MiD51陽性表達(dá)率明顯高于對照組(χ2=20.508，P<0.05)。

2.2 不同臨床特征卵巢癌患者M(jìn)iD51表達(dá)情況比較 見表1。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化卵巢癌患者M(jìn)iD51陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化患者(均P<0.05)。MiD51陽性表達(dá)與卵巢癌患者年齡、絕經(jīng)、病理類型、FIGO分期、腫瘤直徑、腹水、肌層浸潤深度無相關(guān)性(均P>0.05)。

2.3 MiD51陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者OS、PFS比較 80例卵巢癌患者的隨訪時間為9～50個月，中位隨訪時間為38個月。MiD51陽性表達(dá)患者OS為(30.41±1.93)個月，95%置信區(qū)間(CI)為(26.83～33.99)個月；PFS為(18.69±2.10)個月，95%CI為(14.58～22.79)個月。MiD51陰性表達(dá)患者OS為(44.79±1.40)個月，95%CI為(42.06～47.53)個月；PFS為(26.70±2.44)個月， 95%CI為(21.92～31.47)。經(jīng)Log-Rank檢驗，MiD51陽性表達(dá)患者OS和PFS均明顯低于MiD51陰性表達(dá)患者(χ2=16.721、10.130，均P<0.05)。

A：MiD51呈陽性表達(dá)；B：MiD51呈陰性表達(dá)

表1 不同臨床特征卵巢癌患者M(jìn)iD51表達(dá)情況比較[例(%)]

2.4 影響卵巢癌患者生存的危險因素單因素分析 見表2。80例卵巢癌患者中，3年生存率為58.75%(47/80)。殘留病灶直徑≥1 cm和MiD51陽性卵巢癌患者3年生存率明顯低于殘留病灶直徑<1 cm和MiD51陰性患者(均P<0.05)。年齡、絕經(jīng)、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化類型、FIGO分期、肌層浸潤深度、腹水、化療療程均與卵巢癌患者3年生存率無相關(guān)性(均P>0.05)。

2.5 影響卵巢癌患者生存的危險因素COX回歸分析 將殘留病灶直徑≥1 cm(是=1，否=0)和MiD51陽性(是=1，否=0)作為自變量進(jìn)行COX回歸分析，結(jié)果表明殘留病灶直徑≥1 cm(OR=2.651，95%CI=1.361～5.162)和MiD51陽性(OR=3.393，95%CI=1.577～7.299)均為影響卵巢癌患者生存的獨(dú)立危險因素(均P<0.05)。

表2 影響卵巢癌患者生存的危險因素單因素分析[例(%)]

3 討 論

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中的發(fā)生率僅低于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，其病死率較高，患者明確診斷時往往已至晚期，且常合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使手術(shù)療效有限，患者預(yù)后較差[5]。尋找敏感性標(biāo)志物以實現(xiàn)對卵巢癌的早期防治至關(guān)重要。目前認(rèn)為，卵巢癌的發(fā)生涉及激素、免疫、遺傳等多種因素，但其發(fā)生的分子機(jī)制尚未明確[6]。線粒體可參與細(xì)胞氧化還原等多種生理機(jī)制的調(diào)控，其中分裂與融合之間的平衡為線粒體生理功能發(fā)揮的重要保障。目前認(rèn)為，腫瘤組織中線粒體分裂活性明顯提高，可通過細(xì)胞代謝、凋亡等多種生理機(jī)制參與腫瘤的進(jìn)展[7]。MiD51為線粒體動態(tài)蛋白，主要在線粒體外膜上表達(dá)，研究[8]發(fā)現(xiàn)其可明顯提高肝癌細(xì)胞的遷移能力，促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。但是目前關(guān)于其與卵巢癌的相關(guān)性尚未明確。

目前認(rèn)為，線粒體在細(xì)胞中的分裂和融合在調(diào)控線粒體分布、形態(tài)等的同時，其功能異常還可參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其中MiD51異常活化可促使腫瘤細(xì)胞中線粒體的碎片化，并可通過調(diào)控細(xì)胞分裂的G1/S期促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖以及對凋亡信號的抑制[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，MiD51在卵巢癌組織中的表達(dá)上調(diào)，提示MiD51可能參與卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展，這可能與MiD51可通過與動力相關(guān)蛋白1(DRP1)的相互作用并將其招募到線粒體外膜中參與線粒體分裂調(diào)控相關(guān)[10]。研究[11-14]發(fā)現(xiàn)，裂變蛋白1(Fis1)、MiD51等均可參與DRP1的募集和線粒體裂變，且在無Fis1的情況下MiD51也可起到招募DRP1并增強(qiáng)DRP1表達(dá)的作用，提示MiD51可能通過對DRP1的作用參與線粒體分裂的調(diào)控；非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中DRP1表達(dá)明顯高于非癌組織，且通過抑制肺癌細(xì)胞中的線粒體分裂可明顯抑制癌細(xì)胞生長，表明肺癌的發(fā)生、發(fā)展與線粒體分裂具有明顯的相關(guān)性；甲狀腺鱗癌細(xì)胞中DRP1表達(dá)明顯升高，提示線粒體動力學(xué)的異常可能與甲狀腺鱗癌的發(fā)生明顯相關(guān)，并可促進(jìn)甲狀腺鱗癌細(xì)胞的侵襲性；通過使用DRP1抑制劑Mdivi-1可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并可促使腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步表明線粒體凋亡可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

線粒體分裂活性的增加可使線粒體在細(xì)胞核周圍片段化，進(jìn)而形成有利于腫瘤細(xì)胞增殖的微環(huán)境，其中通過下調(diào)DRP1的表達(dá)可明顯降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力，促使腫瘤細(xì)胞的凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，MiD51表達(dá)與卵巢癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，MiD51在肝癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平明顯高于原發(fā)灶，且下調(diào)MiD51表達(dá)可明顯降低肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，提示MiD51可能參與肝癌細(xì)胞遷移；乳腺癌組織中DRP1表達(dá)上調(diào)可促使線粒體在板狀偽足區(qū)域中的分布，進(jìn)而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞遷移性，提示MiD51表達(dá)與卵巢癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性可能是通過對DRP1的調(diào)控促使板狀偽足形成，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移，但是具體機(jī)制仍需深入研究。

線粒體分裂的過度活化能夠促使惡性腫瘤中肌成纖維細(xì)胞能量代謝發(fā)生異常，進(jìn)而有利于腫瘤新生血管的生成和增殖[18]。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，線粒體分裂與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)，這與本研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，MiD51陽性表達(dá)患者OS和PFS均明顯低于MiD51陰性表達(dá)患者，且為影響卵巢癌患者生存期的獨(dú)立危險因素。研究[20-22]發(fā)現(xiàn)，MiD51表達(dá)與乳腺癌患者的腫瘤直徑和分級呈正相關(guān)，與非小細(xì)胞肺癌患者的生存率呈負(fù)相關(guān)；線粒體分裂與腫瘤耐藥明顯相關(guān)，線粒體動力學(xué)功能障礙在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，Mdivi-1可增強(qiáng)癌細(xì)胞中順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)對化療的敏感性；DRP1在乳腺癌中的表達(dá)明顯上調(diào)，且其表達(dá)與患者不良生存顯著相關(guān)，DRP1與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)，提示DRP1可通過免疫浸潤影響乳腺癌患者的預(yù)后。因此，MiD51可能是通過與DRP1的相互作用對卵巢癌患者的預(yù)后產(chǎn)生一定的影響，但是具體機(jī)制仍需深入研究。

綜上所述，MiD51在卵巢癌組織中高表達(dá)，并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度以及生存期相關(guān)，可作為卵巢癌診斷和患者預(yù)后評估的相關(guān)依據(jù)。