Wiskott-Aldrich綜合征蛋白家族成員3對(duì)非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究

崔 凱，白峻峰，公孫鑫，支亞男，王壯壯，姜 琨，賈 明

(1.西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院胸腔外科，陜西 西安 710100；2.陜西省中醫(yī)藥研究院， 陜西 西安 710003)

肺癌是全世界病死率最高的癌癥，侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其臨床治療失敗和預(yù)后差的主要原因[1-5]。因此，研究肺癌侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制具有十分重要的臨床意義。Wiskott-Aldrich綜合征蛋白家族成員3(Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 3，WASF3-AS1)是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，已被證實(shí)在各種類型的人類癌癥中具有預(yù)后評(píng)估價(jià)值，然而其在非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)中的表達(dá)以及對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響與機(jī)制目前尚不明確[6-9]。因此，本研究觀察WASF3-AS1在NSCLC中的表達(dá)及對(duì)其侵襲轉(zhuǎn)移的影響并分析其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 26例臨床不同病理分期NSCLC患者的癌組織及癌旁組織。NSCLC細(xì)胞系NCI-H1975細(xì)胞和正常肺支氣管上皮細(xì)胞系HBE細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑 WASF3-AS1抗體(ab13365)、賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(LSD1)抗體(ab25667)、組蛋白去乙?；?(HDAC6)抗體(ab86657)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)抗體(ab12655)、蛋白激酶B (AKT)抗體(ab2546)、磷酸化AKT(p-AKT)抗體(ab2587)、E-鈣黏蛋白(E-ca)抗體(ab43235)、N-鈣黏蛋白(N-ca)抗體(ab47643)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體(ab10897)均購(gòu)自Abcam。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔6×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板繼續(xù)培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)染W(wǎng)ASF3-AS1慢病毒載體：取5 μl WASF3-AS1-pc-DNA3.1(+)和Lipofectamine 2000與50 μl Opti-MEM混勻室溫靜置5 min，將小干擾RNA(siRNA)混合液緩慢加入Lipofectamine 2000混合液中室溫避光靜置20 min。分別取上述混合液200 μl加入6孔板，37 ℃、5% CO2條件下轉(zhuǎn)染8 h，更換完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)：采用組織研磨機(jī)將臨床NSCLC患者癌組織及癌旁組織樣本勻漿后加入TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA。反應(yīng)嚴(yán)格按照Takara公司試劑盒進(jìn)行操作?；蛳鄬?duì)表達(dá)量以2-ΔΔCT計(jì)算。檢測(cè)臨床組織及細(xì)胞中WASF3-AS1、LSD1、HDAC6、PTEN、AKT、E-ca和N-ca mRNA表達(dá)水平。PCR引物序列如下：WASF3-AS1正向?yàn)?’-TGATAACTGAGCCA-

AAGTGGTGATG-3’，反向?yàn)?’-TGGCGTATGATAGCGGCAAG-3’；LSD1正向?yàn)?’-TACCGTCAAG-

CTCTTGGCA-3’，反向?yàn)?’-AGCCAAGAGCTTGACGGTA-3’；HDAC6正向?yàn)?’-TCCATTTTACTTTCCTACCAT-3’，反向?yàn)?’-ATGGTAGGAAAGTAAAATGGA-3’；PTEN正向?yàn)?’-ACGACACAGGAGAGTTTGAC-3’，反向?yàn)?’-GTCAAACTCTCCTGTGTCGT-3’；AKT正向?yàn)?’-TCGGTCTGACCTCCCCGACC-3’，反向?yàn)?’-GGTCGGGGAGGTCAGACCGA-3’；E-ca正向?yàn)?’-TACCGTCAAGCTCTTGGCA-3’，反向?yàn)?’-TGCCAAGAGCTTGACGGTA-3’；N-ca正向?yàn)?’-TCCATTTTACTTTCCTACC-3’，反向?yàn)?’-GGTAGGAAAGTAAAATGGA-3’；GAPDH正向?yàn)?’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向?yàn)?’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

1.3.3 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)染W(wǎng)ASF3-AS1-pc-DNA3.1(+)的NCI-H1975細(xì)胞，消化重懸細(xì)胞后于96孔板內(nèi)每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。分別于細(xì)胞接種后1、2、3、4、5 d同一時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μl CCK8溶液于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)孵育1～4 h。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀與450 nm處讀取光密度(OD)值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 劃痕細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)染W(wǎng)ASF3-AS1-pc-DNA3.1(+)的NCI-H1975細(xì)胞，消化重懸細(xì)胞后于6孔板內(nèi)每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。次日，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔底部約90%時(shí)開始劃痕并標(biāo)記，棄上清并用PBS緩沖液清洗3次，更換基礎(chǔ)高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。劃痕后0、12 、24 h時(shí)分別拍照記錄細(xì)胞劃痕愈合情況。

1.3.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：4 ℃冰箱過夜融化細(xì)胞基質(zhì)膠(Matrigel)后用預(yù)冷的無血清DMEM培養(yǎng)基以1∶9稀釋，每孔加上述稀釋液40 μl，于37 ℃、5% CO2孵箱中孵育5 h。棄殘余液體，每孔加60 μl基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基水化基底膜，30 min后棄培養(yǎng)液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)染W(wǎng)ASF3-AS1-pc-DNA3.1(+)的NCI-H1975細(xì)胞，消化重懸細(xì)胞后于6孔板內(nèi)每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板內(nèi)Transwell小室上室，下室加600 μl含完全DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞侵襲20 h后取出培養(yǎng)板，棄上清，PBS清洗后分別加600 μl 4%多聚甲醛溶液和0.1%結(jié)晶紫染液室溫固定和染色15 min，PBS清洗后用棉簽輕輕擦去Transwell小室上室未遷移和侵襲細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野觀察被染成紫色的穿過膜的細(xì)胞并拍照記錄細(xì)胞遷移和侵襲情況，采集圖像后采用Image J軟件計(jì)數(shù)，采用Graph Pad計(jì)算分析。33%冰乙酸溶液脫色后采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm處讀取OD值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)遷移和侵襲率。

1.3.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)染W(wǎng)ASF3-AS1-pc-DNA3.1(+)的NCI-H1975細(xì)胞，消化離心后采用100 μl PIPA裂解液和0.15 μl PMSF裂解液室溫裂解細(xì)胞5 min，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，吸取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算30 μg蛋白上樣體積，并進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，ECL發(fā)光儀檢測(cè)并記錄蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織、細(xì)胞中mRNA表達(dá)比較 見圖1。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織和NCI-H1975細(xì)胞中WASF3-AS1、LSD1、HDAC6、PTEN和E-ca mRNA表達(dá)分別較癌旁組織和HBE細(xì)胞明顯降低，而AKT和N-ca mRNA表達(dá)分別較癌旁組織和HBE細(xì)胞明顯增加(均P<0.05)。

注：圖A中，與癌旁組織比較，*P<0.01；圖B中，與HBE細(xì)胞比較，*P<0.01

2.2 WASF3-AS1-pc-DNA3.1(+)轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，肺癌NCI-H1975細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)ASF3-AS1-pc-DNA3.1(+)表達(dá)上調(diào)4.73倍(P<0.05)。

2.3 兩組細(xì)胞增殖能力比較 見圖2。CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，WASF3-AS1過表達(dá)的NCI-H1975細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)。

2.4 兩組細(xì)胞遷移能力比較 見圖3。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，WASF3-AS1過表達(dá)的NCI-H1975細(xì)胞劃痕愈合能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，提示W(wǎng)ASF3-AS1可抑制NCI-H1975細(xì)胞的遷移。

2.5 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 見圖4。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，WASF3-AS1過表達(dá)的NCI-H1975細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，提示W(wǎng)ASF3-AS1可抑制NCI-H1975細(xì)胞侵襲。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01

注：左圖為不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞劃痕愈合情況；右圖中，與對(duì)照組比較，*P<0.01

注：左圖為兩組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(結(jié)晶紫染色，×400)；右圖中，與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.6 兩組細(xì)胞LSD1、HDAC6、PTEN、p-AKT和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)標(biāo)志分子蛋白表達(dá)水平比較 見圖5。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，WASF3-AS1過表達(dá)可顯著上調(diào)LSD1、HDAC6和PTEN，并抑制p-AKT及肺癌EMT激活(均P<0.05)，提示W(wǎng)ASF3-AS1通過募集LSD1和HDAC6可抑制PTEN/AKT信號(hào)活化介導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。

注：左圖為各蛋白電泳圖；右圖中，與對(duì)照組比較，*P<0.01

3 討 論

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤，多數(shù)肺癌患者即使經(jīng)過手術(shù)及放、化療等聯(lián)合治療，其術(shù)后總體5年生存率仍較低，且近年來腫瘤的發(fā)病率和病死率逐漸增加，也越來越趨于年輕化發(fā)展[10-11]。NSCLC是臨床肺癌患者臨床常見類型[12]。近年來，隨著基于細(xì)胞和分子特征的精準(zhǔn)基因靶向治療醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，NSCLC的治療手段及患者預(yù)后得到一定改善。然而較高的侵襲轉(zhuǎn)移率及術(shù)后復(fù)發(fā)率是導(dǎo)致肺癌患者臨床治療失敗和高病死率的主要原因[13-14]。因此，闡明誘發(fā)NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的靶分子及其作用機(jī)制具有重要意義。

WASF3是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，能夠抑制乳腺癌、宮頸癌、肝癌、前列腺癌以及膀胱癌多種實(shí)體腫瘤的惡性演變[15]。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是由多因素參與調(diào)控的復(fù)雜過程，在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，WASF表達(dá)缺失能夠誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，與患者臨床病理分期及不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[16-17]。此外，研究[18]表明WASF3在乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)降低甚至缺失，上調(diào)WASF3的表達(dá)能夠明顯抑制上述腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。上述研究結(jié)果表明WASF3作為抑癌基因抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究qRT-PCR結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織和NCI-H1975細(xì)胞中WASF3-AS1、LSD1、HDAC6和E-ca表達(dá)較癌旁組織和HBE細(xì)胞明顯增加，而AKT和N-ca表達(dá)較癌旁組織和HBE細(xì)胞明顯降低，表明WASF3-AS1募集的LSD1和HDAC6表達(dá)能夠抑制NSCLC的EMT。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證WASF3-AS1對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究中通過慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建了WASF3-AS1過表達(dá)NCI-H1975細(xì)胞系，CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕遷移實(shí)驗(yàn)以及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)均證實(shí)WASF3-AS1過表達(dá)能明顯抑制NCI-H1975細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

PTEN/AKT信號(hào)通路活化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[19-20]。PTEN是該通路主要因子之一，通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的功能并對(duì)抗AKT的活化，進(jìn)而抑制多種惡性腫瘤如腦膠質(zhì)瘤、胃癌及黑色素瘤等的發(fā)生與發(fā)展。此外，PI3K的核心功能在于介導(dǎo)組織細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞內(nèi)活化的PI3K可激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并與PI3K蛋白相互作用轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核或細(xì)胞漿，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞活性并抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織和NCI-H1975細(xì)胞中PTEN的表達(dá)降低甚至缺失，進(jìn)而促進(jìn)其介導(dǎo)的PI3K/AKT致癌信號(hào)通路活化，最終促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究結(jié)果證實(shí)，WASF3-AS1過表達(dá)能夠明顯上調(diào)NCI-H1975細(xì)胞中PTEN及上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-ca的表達(dá)，降低活化的p-AKT和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-ca的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和EMT。

綜上所述，WASF3-AS1對(duì)于抑制NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移以及患者術(shù)后復(fù)發(fā)具有重要作用，可能通過LSD1和HDAC6到靶基因PTEN啟動(dòng)子區(qū)，上調(diào)PTEN表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)下游PI3K/AKT致癌信號(hào)通路失活，發(fā)揮抗NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用。