丹皮酚對心肌缺血再灌注損傷保護中Toll樣受體4、心肌焦亡影響的作用機制

丁華勝，黃 燕，王鳳媛

(1.武漢科技大學附屬普仁醫院急診科，湖北 武漢 430081；2.武漢大學心血管病研究所，湖北 武漢 430060)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)指心肌組織長時間缺血后給予重新血液灌流后組織損傷反而呈進行性加重的病理過程，其機制主要涉及心肌收縮機能減弱、冠脈流量減少以及血管反應性改變，目前普遍認為細胞焦亡與炎癥反應參與了MIRI的病理過程[1-3]。細胞焦亡是以促炎性為特點細胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)的新途徑，其對半胱天冬酶(Caspase)-1具有依賴性且合并炎癥級聯反應，同時受到內源性與外源性刺激后產生炎性小體，對下游白介素(Interleukin,IL)-1β 以及IL-18進行誘導并致其活化，生成相關胞內物質，從而介導組織細胞損傷[4-5]。有研究證實，在糖尿病大鼠MIRI模型中，糖尿病大鼠對缺血再灌注敏感性增加，從而加劇MIRI，其機制同NOD樣受體家族Pyrin域3(Nod like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)/Caspase-1依賴性細胞焦亡效應有著緊密聯系[6]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4) 是一類天然免疫受體，其分布極為廣泛，在炎癥反應和氧化應激下大量釋放，研究表明 TLR4在MIRI中發揮重要作用[7]。

丹皮酚提取自毛茛科植物牡丹的干燥根皮，屬于酚類化合物，其味苦且辛，分子量較小，呈白色針狀結晶，具有神經保護、抗腫瘤、抗脂質過氧化、消炎、消腫止痛、抗過敏、抗病毒等作用[8-9]。前期研究證實，丹皮酚可通過抑制心肌凋亡保護MIRI大鼠的心肌組織[10-11]。此次實驗擬對丹皮酚的心肌保護功能以及對TLR4表達、細胞焦亡的影響進行探討分析，旨在為丹皮酚的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物： 清潔級雄性SD 大鼠56只，體重220～280 g，均由武漢大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑與儀器：TLR4兔多抗(Abcam公司)；戊巴比妥鈉；99%純度的丹皮酚，各濃度由0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)制備；TTC試劑；NLRP3、Caspase-1、凋亡相關斑點蛋白(Apoptosis related specklein，ASC)以及IL-1β兔多抗；顯微鏡(OLYMPUS公司)；低溫高速離心機(型號Hitachi CF-5，Japan)；千分之一天平(MET-TLER)；動物呼吸機(浙江大學動物儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的建立、分組與給藥：將56只大鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注組、丹皮酚低劑量組(15 mg/kg)及丹皮酚高劑量組(30 mg/kg)，每組14只。丹皮酚低劑量組、丹皮酚高劑量組大鼠均在術前10 d起予丹皮酚溶液腹腔注射，劑量分別為15、30 mg/kg，1次/d。假手術組、缺血再灌注組分別予等劑量的0.9%氯化鈉溶液，1次/d。各組大鼠均連續干預10 d。藥物干預后，除假手術組外，其余組參照黃鑫等[11]實驗研究建立MIRI大鼠模型。MIRI大鼠模型建立步驟：取SD大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，戊巴比妥鈉劑量為30 mg/kg，麻醉后予氣管插管，連接小動物呼吸機，于胸骨左側3 mm第4肋間打開胸腔，分離心包后暴露心臟，采用5-0絲線伸至左心耳下緣冠狀動脈前降支(Left anterior descending coronary，LAD)發端部位約2 mm處，在結扎線下置入乳膠管后收緊結扎線并打結，阻斷0.5 h后剪斷結扎線，再灌注4 h。模型建立成功判定標準：結扎線結扎后通過動物心電圖標準導聯發現ST-T明顯抬高，剪斷結扎線后，ST-T有所降低。假手術組大鼠僅打開胸腔，不進行血管結扎操作，后縫合術口。

1.2.2 心肌梗死面積的測定：再灌注4 h后對冠脈進行結扎處理，于頸動脈處注入伊文斯藍1.0 ml，分離心臟，緩沖液沖洗心臟后，去除脂肪、心房、血管等組織，濾紙吸收左心室水分后放置于-20 ℃冰箱冷凍處理。冷凍處理后，取出心臟，心尖朝上，對心室進行切片處理，共切5片，厚度均勻一致，然后進行2,3,5-氯化三苯基四氮唑藍(Terazolium chloride,TTC)染色法染色，若未見藍染則為危險區，顯示灰白色則為梗死區，根據染色對梗死面積進行計算。

1.2.3 心肌酶測定：再灌注4 h后，采集大鼠動脈血，離心后取血清，采用全自動生化分析儀檢測肌酸激酶同工酶(Creatinekinase MB，CK-MB)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活性。

1.2.4 免疫組化法檢測TLR4蛋白：各組隨機選擇5只大鼠采用免疫組化方法檢測TLR4蛋白水平，光鏡下觀察心肌細胞胞漿均質顆粒，若顯示棕黃色則判定為陽性細胞。每張免疫組化切片隨機在顯微圖像采集系統輔助下取5個400×視野，通過圖像分析軟件Image Pro Plus 5.0計算陽性細胞的平均積分光密度(Average integrated optical density，AIOD)，從而得出TLR4蛋白表達水平。

1.2.5 免疫印跡(Western blot)法檢測心肌組織NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β表達：大鼠再灌注處理4 h后，采集左心室心肌組織(處于結扎線水平以下)，然后參照分子質量配制12%PAGE膠，電泳后轉膜,用5%的脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育一抗過夜，用NLRP3、Caspase-1、ASC和IL-1β對應的HRP標記的二抗孵育，再實施ECL顯色處理，以β-actin為內參，計算NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β的相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 根據TTC染色法計算心肌梗死面積，與缺血再灌注組比較，丹皮酚低劑量組、丹皮酚高劑量組大鼠心肌梗死面積均減小，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較(%)

2.2 各組大鼠血清CK-MB、LDH活性比較 見表2。與假手術組比較，缺血再灌注組CK-MB、LDH水平均升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與缺血再灌注組比較，丹皮酚低劑量組、丹皮酚高劑量組CK-MB、LDH活性均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清CK-MB、LDH活性比較(U/ml)

2.3 各組大鼠心肌組織TLR4蛋白表達比較 見表3。與假手術組比較，缺血再灌注組TLR4蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，丹皮酚低劑量組、丹皮酚高劑量組TLR4蛋白表達水平均降低，且丹皮酚高劑量組低于丹皮酚低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠心肌組織TLR4蛋白表達比較

2.4 各組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β表達比較 見表4(圖1)。與假手術組比較，缺血再灌注組心肌組織的NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β表達均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，丹皮酚低劑量組、丹皮酚高劑量組NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β表達均降低，且丹皮酚高劑量組均低于丹皮酚低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β表達比較

A:假手術組;B:缺血再灌注組;C:丹皮酚低劑量組;D:丹皮酚高劑量組

3 討 論

細胞焦亡是近期發現的一類促炎性PCD，其對Caspase-1主要參與的經典炎癥小體通路具備依賴性[4]。炎癥小體屬于多蛋白復合體，其在細胞質中模式識別受體作用下組裝而成，可對諸多不同刺激加以識別，再通過諸如NLRC4、NLRP3或NLRP1此類NOD樣受體蛋白以及ASC、Caspase-1前體蛋白經由結構域組裝，并激活Caspase-1，作用于IL-1β、IL-18等下游因子，促使兩者前體裂解與釋放，介導細胞滲透性腫脹破裂，產生細胞膜小孔，導致LDH此類胞內成分流出，同時對其它炎癥介質、黏附分子的合成與釋放進行誘導，導致全身與局部炎癥反應放大，引發細胞焦亡[12]。在現今所研究的NOD 樣受體中，涉及最多的為NLRP3炎癥小體，其主要包括NLRP3、Caspase-1、ASC。對于非微生物危險信號，NLRP3具備炎癥識別功能，過表達的ATP、結晶、葡萄糖、膽固醇、活性氧均能夠使NLRP3活化，NLRP3可在各類疾病環境中對非微生物危險信號進行有效識別，同時引發非細菌性炎癥反應[13]。如細胞表面受體介導的信號通路包括涉及TLR4的通路，在調節焦亡相關的發病機制中發揮重要作用[14-15]。

作為一類信號轉導受體蛋白，TLR4同免疫炎癥存在緊密聯系，其大量分布于巨噬細胞、單核細胞等，并高表達于心肌，目前已明確其信號轉導途徑，TLR4激活后通過依賴Myd88髓系分化因子和非依賴Myd88傳遞信號，最終導致核轉錄因子 (Nuclear factor-κB，NF-κB) 的活化，發生核移位，引起一系列的炎癥反應[7,16]。既往研究表明，NLRP3及其下游信號通路引起的焦亡受TLR4介導的機制調節，并進一步加重組織損傷[17-18]。研究證實，在MIRI模型中，microRNA-149通過NLRP3/Caspase-1焦亡通路加重了MIRI[2]。Dai等[19]證實，M2巨噬細胞源性外顯子攜帶microRNA-148a，通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥信號通路可下調心肌焦亡減輕心肌缺血再灌注損傷。本實驗結果顯示，與假手術組比較，缺血再灌注組大鼠心肌梗死面積明顯增加，血清CK-MB和LDH的活性升高，TLR4的釋放增加，NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表達增加，證明本實驗成功制備了大鼠MIRI模型，且TLR4及NLRP3/ASC/Caspase-1焦亡通路促進了MIRI。本實驗通過丹皮酚預處理觀察對MIRI的影響，發現丹皮酚干預后，TLR4蛋白釋放減少，同時NLRP3/ASC及Caspase-1信號途徑活化降低，進而下調細胞焦亡，減少了心肌梗死面積，且丹皮酚高劑量組較丹皮酚低劑量組作用更明顯。丹皮酚通過抑制TLR4的激活，減少核轉錄因子NF-κB的活化，抑制NLRP3/ASC/Caspase-1信號通路介導的細胞焦亡，減輕炎癥反應，保護心肌。