連術消渴顆粒對2型糖尿病模型大鼠腸道菌群、腸黏膜屏障功能及水通道蛋白的影響

李慧敏,李鵬輝,吉蘭潔,閆 鏞

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.開封市中醫院，河南 開封 475000)

2型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)是常見的內分泌疾病，預計2045年，全球T2DM患者將達到6.29億[1]。T2DM發病率高，發病機制復雜，易引起腸道菌群變化及腸道相關并發癥，腸道菌群的變化亦可影響T2DM的發生和發展[2-3]。糖尿病患者易并發腹瀉，其機制可能與外周血高糖引發腸黏膜屏障損傷及水通道蛋白表達異常有關[4-5]。連術消渴顆粒是閆鏞教授治療T2DM的經驗方，臨床證實其治療T2DM療效較好[6]。本研究擬通過腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)制備T2DM大鼠模型，觀察連術消渴顆粒對T2DM模型大鼠糖代謝、腸道菌群、腸黏膜屏障功能及結腸水通道蛋白的影響，從多重角度初步闡釋連術消渴顆粒干預T2DM的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：60只健康SPF級SD雄性大鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，體重200～220 g，動物合格證號1107261911004137、生產許可證號SCXK(魯)20190003、實驗室使用許可證編號SYXK(豫)2015-0005，于22 ℃、50%濕度條件下飼養。

1.1.2 實驗藥物：連術消渴顆粒由黃連、澤瀉、山楂各30 g，蒼術、枳實、制半夏、陳皮各10 g，升麻、干姜、甘草各6 g，茯苓20 g，水蛭3 g，大棗3枚組成，由廣東一方制藥有限公司制成顆粒劑。

1.1.3 實驗試劑與儀器：STZ(批號LF20191009，北京六一生物科技公司)；D-乳酸(D-lactic acid，D-LA)、連蛋白(Zonulin)ELISA 試劑盒(批號WHB647235、WHB647305，美國Cloud-Clone Corp公司)；乳脂球表皮生長因子-8(Milk fat globule EGF factor-8，MFG-E8)(批號ab235638，英國Abcam科技公司)；水通道蛋白4(Aquaporin 4，AQP4)、水通道蛋白8(Aquaporin 8，AQP8)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh)單克隆抗體(批號ab125049、ab133667，英國Abcam公司)；ChemDoc XRS型化學發光成像儀(美國Bio-rad公司)、703940型半干轉膜儀(美國Bio-rad公司)、1703539型垂直電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模、分組及給藥：60只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、連術消渴顆粒低劑量組、連術消渴顆粒中劑量組、連術消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組，每組各10只。空白組正常喂養，其余各組大鼠喂養高脂高糖飼料，大鼠飼養30 d后禁食12 h，腹腔注射STZ，劑量為45 mg/kg，空白組大鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。1周后，大鼠尾部少量取血，若空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)≥11.1 mmol/L，隨機血糖≥16.7 mmol/L提示2型糖尿病造模成功[6]。模型組、連術消渴顆粒低劑量組、連術消渴顆粒中劑量組、連術消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組最終分別成模8、8、9、8、9只。連術消渴顆粒低劑量組、連術消渴顆粒中劑量組、連術消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組大鼠分別給予連術消渴顆粒2.92、5.84、11.68 g/(kg·d)及鹽酸二甲雙胍片0.17 g/(kg·d)灌胃，空白組及模型組給予相同劑量的純凈水灌胃，各組大鼠均治療30 d。

1.2.2 糖代謝相關指標檢測：采用江蘇魚躍血糖儀檢測各組大鼠血漿FBG水平，采用放射免疫分析法檢測各組大鼠空腹血清胰島素(Fasting serum lisulin，FINS)水平，并計算胰島素抵抗指數(Homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)。HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.2.3 腸道菌群檢測：治療30 d末取各組大鼠糞便0.2 g于無菌培養皿中，加入糞便體積10倍雙蒸水稀釋，充分震蕩后形成均質化懸濁液，依次進行10倍系列稀釋至10-7。不同稀釋度選擇需氧、厭氧培養基進行菌群培養，培養條件參照文獻進行，對各組菌落數統計[7]。每克糞便的細菌數=菌落數×10 n×40，結果以每克糞便中的細菌菌落數的對數值Log CFU/g表示。

1.2.4 腸黏膜屏障功能檢測：抽取各組大鼠外周血，2000 r/min條件下分離血清，采用ELISA法檢測各組大鼠血清中D-LA、Zonulin及MFG-E8含量，操作流程嚴格按照說明書進行。

1.2.5 水通道蛋白檢測：取各組大鼠結腸組織并制備組織勻漿，應用冷研磨法破壞組織，BCA法測定各樣本蛋白濃度。各組均取10 μl樣本液和5 μl蛋白Marker加入電泳裝置中，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，待電泳結束后將含蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉移到PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉4 h，加入AQP4一抗、AQP8一抗4 ℃封閉過夜，次日取出PVDF膜，PBS液洗膜3次，加入二抗后常溫下孵育2 h，取出PVDF膜，PBS液洗膜3次，ECL顯像，暗室曝光，掃描膠片，采用凝膠圖象處理系統分析結果。實驗獨立重復3次。目標蛋白相對表達量=目的蛋白的灰度值/Gapdh的灰度值。

2 結 果

2.1 各組大鼠糖代謝指標比較 見表1。與空白組比較，模型組大鼠FINS降低，FBG、HOMA-IR水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，連術消渴顆粒低劑量組、連術消渴顆粒中劑量組、連術消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組FINS水平均升高，FBG、HOMA-IR水平均降低，且呈劑量依賴性，差異有統計學意義(均P<0.05)。

表1 各組大鼠糖代謝指標比較

2.2 各組大鼠腸道菌群比較 見表2。與空白組比較，模型組大鼠糞便培養中大腸桿菌數量增加，雙歧桿菌、乳酸桿菌數量降低，差異有統計學意義(均P<0.05)；與模型組比較，連術消渴顆粒低劑量組、連術消渴顆粒中劑量組、連術消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組大鼠糞便培養中大腸桿菌數量降低，雙歧桿菌、乳酸桿菌數量增加，且呈劑量依賴性，差異有統計學意義(均P<0.05)。

表2 各組大鼠腸道菌群比較(Log CFU/g)

2.3 各組大鼠腸黏膜屏障功能標記物比較 見表3。與空白組比較，模型組大鼠血清腸黏膜屏障功能標記物D-LA、Zonulin含量升高，MFG-E8含量降低，差異有統計學意義(均P<0.05)。與模型組比較，連術消渴顆粒低劑量組、連術消渴顆粒中劑量組、連術消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組大鼠血清中D-LA、Zonulin含量降低，MFG-E8含量升高，且呈劑量依賴性，差異有統計學意義(均P<0.05)。

表3 各組大鼠腸黏膜屏障功能標記物比較

2.4 各組大鼠結腸水通道蛋白表達比較 見表4(圖1)。與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中AQP4、AQP8表達均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，連術消渴顆粒低劑量組、連術消渴顆粒中劑量組、連術消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組AQP4、AQP8表達均升高，且呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠結腸組織中AQP4、AQP8表達比較

A：空白組；B：模型組；C：連術消渴顆粒低劑量組；D：連術消渴顆粒中劑量組；E:連術消渴顆粒高劑量組;F：二甲雙胍組

3 討 論

糖尿病屬于中醫“消渴”范疇，由近代醫家張錫純首次明確“消渴”即糖尿病。糖尿病有虛實燥熱之別，主要病機為脾胃受損、升降運化失司、濕熱瘀結所致，治療方面立足于中焦脾胃，立法為運脾清熱，瀉濁化瘀，重鑄中焦運化，方可改善機體對營養物質的吸收，濡養五臟六腑，輸布百骸精微。連術消渴顆粒是閆鏞教授治療T2DM的經驗方，其組成是在“升降散”“黃連溫膽湯”治療消渴病的基礎上，結合多年臨床經驗化裁而來，全方由黃連、蒼術、枳實、升麻、制半夏、陳皮、茯苓、澤瀉、山楂、水蛭、干姜、大棗、甘草組成，共成運脾、宣導、清熱、升陽、通瘀之法，標本兼顧，則脾運、濁化、瘀消，三焦、經絡通暢，消渴自除[8]。

腸道菌群數量龐大，約有500～1000種類型，其數量是人體自身細胞的10倍之多，可與宿主以物質的形式進行信息交流及物質交換，是人體后天獲得的“器官”，參與宿主的生長、生活、營養、代謝和疾病發展過程[9-13]。腸道菌群可通過結構變化影響宿主對營養的需求及情緒變化，導致體重、糖脂代謝、膽汁酸鹽代謝紊亂及免疫失衡，參與T2DM的發病[14]。已有研究證實中藥復方可通過調節腸道菌群，對T2DM起到一定的治療作用[15]。本團隊通過腹腔注射STZ建立經典T2DM大鼠模型，發現T2DM大鼠腸道菌群中大腸桿菌數量增加，雙歧桿菌及乳酸桿菌數量降低，整體腸道菌群結構變化，這與張海平等[16]研究結果相似。通過不同劑量連術消渴顆粒進行干預治療后，大鼠糖代謝功能改善，FINS升高，FBG及HOMA-IR均降低，糞便培養大腸桿菌數量降低，雙歧桿菌及乳酸桿菌數量增加，呈劑量依賴性，并且高劑量組上述指標改善后水平與空白組相近，說明高劑量連術消渴顆粒治療T2DM效果較好，可基本改善大鼠血糖升高及胰島素抵抗狀態，其機制可能與改善腸道菌群結構，增強微生物對糖分酵解作用并調節腸道對糖分吸收功能有關。

腸黏膜屏障功能與糖尿病的發生及發展密切相關，二者互為因果，高糖可破壞腸黏膜完整性，而腸黏膜屏障完整性被破壞導致小腸絨毛性水腫，影響降糖藥物吸收，從而導致血糖升高[17-18]。D-LA、Zonulin及MFG-E8是目前公認的腸黏膜屏障功能血清標志物，雖然三者產生機制不同，但均可準確反映腸黏膜屏障功能狀態[19-20]。本研究發現，T2DM大鼠存在腸黏膜屏障功能損傷，血清D-LA、Zonulin含量升高，MFG-E8含量降低，經連術消渴顆粒治療后，D-LA、Zonulin及MFG-E8水平均得到改善，說明連術消渴顆粒的降糖效果可能與修復腸黏膜屏障功能有關。因此推測連術消渴顆粒對T2DM大鼠腸黏膜屏障功的改善可能是中藥對腸黏膜的直接作用，治療后增強了腸黏膜屏障的完整性；也可能是連術消渴顆粒調整T2DM大鼠腸道菌群結構，減輕對腸黏膜屏障的破壞，有效阻滯腸內微生物、內毒素、有毒食物及食物抗原的入侵，從而改善大鼠自身胰島素抵抗狀態，達到降糖目的。

《傷寒論·辨厥陰病脈證并治第十二》言：“厥陰之為病，消渴，氣上……下之利不止”，津液代謝紊亂是T2DM的特征之一。大腸與肺相表里，主津，是人體水液代謝的重要一環，大腸可吸收食物中的水分，行津液于上焦，清降肺火，又可灌溉肌膚，充實腠理。水通道蛋白是大腸、結腸對水液吸收的主要運載“工具”，既往對T2DM水通道蛋白的研究主要集中在心、肺、腎，結腸中水通道蛋白的報道較少[21]。AQP4、AQP8均在結腸中表達，其中AQP4是目前已知的水轉移能力最強的蛋白，高于其他水通道蛋白3～4倍，AQP8有獨特的水液重吸收功能[22-23]。本研究結果提示，T2DM大鼠結腸組織AQP4、AQP8表達均明顯降低，經高劑量連術消渴顆粒治療后AQP4、AQP8表達均升高至正常水平。說明連術消渴顆粒可改善T2DM大鼠結腸水液代謝功能，一方面可能通過中藥復方直接起效，增加水通道蛋白表達，另一方面可能通過調節大鼠腸道菌群結構、恢復腸黏膜屏障功能而降低血糖，從而對結腸水通道蛋白起到保護作用。

綜上所述，連術消渴顆粒可改善T2DM模型大鼠糖代謝，修復腸黏膜屏障功能，提高結腸水通道蛋白表達，其機制可能與改善腸道菌群有關。