黃芩素下調微小RNA-130a抑制肝癌細胞侵襲機制研究

劉振方，孫巧玉，孟祥彩，武 玉

(1.石家莊市中醫院普外科，河北 石家莊050051；2.石家莊市藁城人民醫院神經內科，河北 石家莊 052160；3.秦皇島市第一醫院普外科，河北 秦皇島 066000)

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)為常見的惡性腫瘤，約占原發性肝癌的90%，隨著醫療水平的發展，HCC患者生存率有所提升，但其發病率逐年升高，且趨于年輕化[1-2]。因此，臨床迫切需要尋求新的治療方法。微小RNA-130a(Micro RNA-130a，miR-130a)屬于轉錄本長度在22～25 nt范圍內的非編碼RNA(Non-coding RNA，ncRNA)[3]。研究顯示，miR-130a在人胃癌組織中高表達，其可能通過誘導上皮間質轉化促進胃癌細胞遷移和侵襲[4]。miR-130a在HCC組織和高轉移性HCC細胞株中高表達，沉默HCC細胞LM3中miR-130a表達可降低細胞侵襲能力，提示miR-130a可促進肝癌細胞侵襲[5]。

近年來一些中藥提取物被證實在抗腫瘤方面具有一定作用，如斑蝥素、槲皮素、羽扇豆醇等。黃芩素(Baicalein)是從中藥黃芩提取的黃酮類化合物。研究顯示，黃芩素可抑制人HCC細胞SMMC-7721增殖、遷移和侵襲[6-7]。研究顯示，黃芩素聯合5-氟尿嘧啶可明顯抑制HCC耐藥細胞增殖并促進其凋亡，進而逆轉細胞對5-氟尿嘧啶的耐藥[8]。但黃芩素能否抑制miR-130a誘導的HCC細胞侵襲目前尚不明確。本研究以HCC細胞HepG2為研究對象，慢病毒轉染法外源性上調miR-130a，觀察黃芩素在miR-130a誘導的細胞侵襲中的作用及機制，為臨床治療HCC提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系：人肝癌HepG2細胞，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 實驗試劑：RPMI 1640培養基(批號C11875500CP)、胎牛血清(FBS，批號2132094P)和磷酸鹽緩沖液(PBS，批號AE29431651)。實時熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物公司)；總蛋白提取試劑盒、細胞裂解液(上海碧云天公司)；miR-130a慢病毒載體和空白載體(山東維真生物公司)；慢病毒包裝試劑盒、轉染脂質體lipofectamine 2000(上海吉瑪公司)；基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)抗體(批號G1220)和鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)抗體(批號L2330,美國圣克魯斯公司)；磷酸甘油醛脫氫酶(Gapdh)抗體(批號201001)、羊抗小鼠IgG-HRP(批號200209)；PVDF膜(美國Millipore公司)。

1.1.3 實驗儀器：臺式高速冷凍離心機(型號Allegra 64R Centrifuge，美國Beckman Coulter公司)；超凈工作臺(型號SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司)；倒置顯微鏡(型號CKX41，日本Olympus公司)；電泳儀、轉膜槽及轉印夾(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(型號AI600，美國GE公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：采用含10% FBS及1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基培養肝癌HepG2細胞，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，生長至70%匯合度進行傳代或凍存。

1.2.2 慢病毒轉染法外源性上調HepG2細胞miR-130a表達：HepG2細胞在12孔板生長至50%匯合度時取出細胞，棄去舊培養基，更換為含10 μg/ml 聚凝胺的RPMI 1640全培養基，將攜帶綠色熒光標簽的miR-130a過表達慢病毒液和空載慢病毒液分別稀釋50倍，各吸取50 μl加入細胞，分別設為miR-130a組、空載對照組，不經任何處理的未轉染細胞作為空白組，培養箱中繼續培養6 h后，更換為RPMI 1640全培養基繼續培養，細胞生長至90%匯合度以嘌呤霉素進行篩選，熒光顯微鏡觀察拍照，以實時熒光定量PCR檢測miR-130a表達。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測細胞miR-130a表達：將細胞傳代至10 cm培養皿中，以20 μmol/L的黃芩素處理24 h，收集細胞，Trizol法提取細胞總RNA，檢測各組細胞總RNA濃度，取1 μg反轉錄為cDNA，并稀釋至500 μl，充分混勻備用。將miR-130a引物按正向引物與反向引物1∶1稀釋，利用實時熒光定量PCR試劑盒在ABI 7300型實時熒光定量PCR系統內擴增。反應條件：95 ℃、10 s，95 ℃、10 s，60 ℃、60 s，40個循環，每組設置3個重復孔，2-△△CT法計算miR-130a的相對表達量。

1.2.4 侵襲小室實驗檢測細胞侵襲能力：取出分裝好的Matrigel膠，以RPMI 1640培養基稀釋至250 μg/ml，吸取100 μl稀釋好的Matrigel膠于小室中，將侵襲小室培養板放置到培養箱靜置3 h。細胞培養至對數期，消化重懸調整細胞密度至1.5×106個/ml，吸取混合均勻的細胞懸液200 μl輕輕加入Transwell小室，以20 μmol/L黃芩素處理。在24孔板小室外的下室中加入800 μl含30% FBS的RPMI 1640培養基，放置于培養箱24 h。24 h后倒掉侵襲小室中的培養基并予PBS清洗2遍，甲醇固定20 min，0.5%結晶紫水溶液染色20 min，PBS清洗2遍，用棉簽輕輕擦掉小室內房細胞，放置5～10 min風干。倒置顯微鏡下觀察，取6個視野拍照并計數，計算細胞侵襲率。

1.2.5 蛋白印跡檢測細胞MMP-9和Calpastatin蛋白表達：收集細胞，于冰盒內以RIPA細胞裂解液裂解細胞10 min，12000 r/min，離心20 min，將上清液轉移至預冷的0.5 ml EP管中，用BCA蛋白定量試劑盒定量，制備含蛋白30 μg/10 μl的蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，以12% SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉膜，5%脫脂牛奶封閉4 h，用MMP-9(1∶1000)、Calpastatin(1∶1000)或Gapdh(1∶1000)于4 ℃搖床孵育過夜，次日孵育羊抗鼠IgG-HRP二抗，以ECL化學發光液顯色，AI600凝膠成像儀下曝光顯影，讀取相應蛋白條帶，以目的蛋白灰度值與相對應的內參蛋白灰度值比較得到相對蛋白表達量。

2 結 果

2.1 各組細胞miR-130a表達水平比較 見圖1(表1)。熒光顯微鏡下，空載對照組和miR-130a組均發出強綠色熒光，提示慢病毒載體進入細胞內。RT-qPCR結果顯示，空白組miR-130a表達水平與空載對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。miR-130a組的miR-130a表達水平高于空載對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，提示外源性過表達miR-130a 的HepG2細胞構建成功。

圖1 各組細胞miR-130a綠色熒光表達情況

表1 各組細胞miR-130a表達水平比較(%)

2.2 各組細胞侵襲能力比較 侵襲小室實驗結果見圖2。空白組、空載對照組及miR-130a組細胞侵襲率分別為100%、(103.9±7.1)%、(385.2±18.1)%，空白組與空載對照組細胞侵襲率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；miR-130a組細胞侵襲率高于空載對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖2 各組細胞侵襲能力比較(結晶紫染色，×100)

2.3 各組細胞MMP-9、Calpastatin蛋白表達比較 蛋白印跡結果見圖3。空白組、空載對照組及miR-130a組細胞MMP-9相對蛋白表達量分別為(18.6±3.0)%、(15.8±4.6)%、(121.3±8.8)%，Calpastatin相對蛋白表達量分別為(112.3±8.6)%、(116.5±9.2)%及(27.6±3.1)%。空白組與空載對照組MMP-9和Calpastatin表達比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。miR-130a組細胞MMP-9表達高于空載對照組，miR-130a組細胞Calpastatin表達低于空載對照組，差異有統計學意義(均P<0.05)。

圖3 各組細胞MMP-9、Calpastatin蛋白表達比較

2.4 黃芩素對miR-130、MMP-9和Calpastatin表達的影響 見表2(圖4)。黃芩素加miR-130a組的miR-130a表達水平低于miR-130a組，差異有統計學意義(P<0.01)。黃芩素加miR-130a組細胞MMP-9表達量低于miR-130a組，黃芩素加miR-130a組細胞Calpastatin表達量高于miR-130a組，差異有統計學意義(均P<0.01)。

表2 各組細胞miR-130a、MMP-9、Calpastatin表達量比較(%)

A：空載對照組；B:miR-130a組；C：黃芩素加miR-130a組

2.5 各組miR-130a誘導細胞侵襲率比較 見圖5。miR-130a組、黃芩素加miR-130a組細胞侵襲率分別為(335.6±26.2)%、(108.8±7.6)%；黃芩素加miR-130a組細胞侵襲率低于miR-130a組，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖5 各組miR-130a誘導細胞侵襲活動(結晶紫染色，×100)

3 討 論

miR-130a作為miRNA的一種，在精子發生、改善血小板功能及腫瘤發生發展等方面發揮重要作用[9-11]。研究顯示，miR-130a在胃癌[4]、肝癌[5]、鼻咽癌[12]及結直腸癌[13]等惡性腫瘤中高表達，且與腫瘤惡性生物學行為密切相關。有研究表明，miR-130a在HCC中發揮一定生物學作用，miR-130a可通過RUNX3和Wnt信號通路促進HCC細胞對順鉑耐藥[14]。另有研究報道，miR-130a在HCC中表達上調，下調miR-130a可抑制HCC細胞的增殖活性，提示miR-130a在HCC中可能發揮促癌作用[15]。但是，Zheng等[16]發現miR-130a通過下調Rho-激酶2抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

細胞侵襲是腫瘤轉移的必要過程之一[17]。本研究結果提示，miR-130a與HepG2細胞的惡性生物學行為有關。進一步實驗發現，過表達miR-130a后HepG2細胞Calpastatin蛋白表達顯著下調，MMP-9蛋白表達明顯上調。Calpastatin是內源性鈣蛋白酶(Calpain,CANP)抑制劑，通過與CANP形成復合體的方式抑制CANP活性[18]。提示miR-130a過表達后HepG2細胞胞內CANP活性增強。MMP-9是基質金屬蛋白酶家族成員之一，研究顯示沉默前列腺癌PC3細胞CANP2表達后，細胞MMP-9 表達下調，說明腫瘤細胞內存在CANP-MMP-9信號通路。且MMP-9能降解細胞外基質成分，破壞組織學屏障，促進腫瘤細胞的侵襲能力。既往有研究報道，黃芩素能抑制HCC細胞的惡性生物學行為[6-8]。因此我們觀察黃芩素在miR-130a誘導的細胞侵襲中的作用，結果發現，黃芩素可抑制miR-130a誘導的細胞侵襲，分子層面研究發現黃芩素能抑制miR-130a誘導的Calpastatin表達下調以及MMP-9表達上調，通過抑制miR-130a激活的CANP-MMP-9通路降低HepG2細胞侵襲活動。黃芩素作為黃芩提取的黃酮類化合物在抗菌、抗炎、抗氧化及抗腫瘤方面均發揮一定作用[19]。

綜上所述，黃芩素能抑制miR-130a誘導的肝癌HepG2細胞侵襲，該作用可能與抑制miR-130a誘導的CANP-MMP-9通路活化有關。本研究處于體外研究階段，需進一步深入研究驗證。