半枝蓮提取物通過PI3K-Akt信號通路抑制胰腺癌模型大鼠腫瘤生長的機制研究

袁文婷,肖茂良,肖 鋒

(湖南中醫藥高等專科學校附屬第一醫院 湖南省直中醫醫院，湖南 株洲412000)

胰腺癌主要臨床表現為乏力、黃疸、食欲不振、腹部疼痛，具有早期診斷率低、惡性程度高、治療難度大、病死率高、預后差的特點，對患者身體健康及生命造成嚴重威脅[1-4]。據相關流行病學調查顯示，近年來我國胰腺癌癥狀發病率呈現上升趨勢[5-6]。有研究表明，胰腺癌治療難度較大，西醫治療胰腺癌的療效并不理想，因此越來越多的專家學者致力于中醫藥治療胰腺癌的研究[7]。有研究證實，中藥提取物干預胰腺癌細胞能夠抑制其增殖，促進胰腺癌細胞凋亡，但是關于中藥提取物干預胰腺癌動物模型的研究鮮有報道[8-9]。本文采用半枝蓮提取物干預胰腺癌模型大鼠，觀察其對胰腺癌細胞、T淋巴細胞亞群、Wnt/β-catenin通路及PI3K-Akt信號通路蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SD健康雄性大鼠40只，由吉林大學動物實驗中心提供，年齡8～10個月，平均(9.0±0.8)個月；體重220～234 g，平均(226.9±4.7)g。在相對濕度50%～55%、溫度(24.1±2.1)℃的環境中喂養大鼠1周，光照12 h/d。

1.1.2 主要試劑：半枝蓮(亳州市億弘堂藥業有限公司)；小鼠抗大鼠Wnt3α抗體(批號H20181002，Hyclone公司)；兔抗大鼠β-catenin抗體(批號H20180901，Selleck公司)；小鼠抗兔PI3K抗體(批號H20181101,Dako公司)；兔抗小鼠Akt抗體(批號H20180801，BD公司)；大鼠抗小鼠mTOR抗體(批號H20181001，Gibco公司)；CD8+、CD4+、CD3+單克隆抗體(批號H20180302、H20180401、H20181001)；PBS(批號H20181102)；蛋白酶K(批號H20181001)；平衡緩沖液(批號H20181201)；SSC溶液(批號H20180701)；TdT酶反應液(批號H20180802)；聚丙烯酰胺凝膠(批號H20181202)。

1.2 實驗方法

1.2.1 半枝蓮提取物制備：半枝蓮50 g粉碎得到半枝蓮粉，按照1∶20比例添加70%乙醇靜置24 h，70 ℃水浴處理4次，2 h/次，過濾，取濾液，按照1∶20比例向藥渣內添加蒸餾水，加熱2 h，取濾液，合并2次所得濾液，按照1 g半枝蓮提取液=5.14 g半枝蓮生藥換算，添加0.9%的氯化鈉溶液配制不同濃度半枝蓮提取物溶液。

1.2.2 建模、分組與給藥：隨機選取10只大鼠為正常組，不做任何處理。其余30只大鼠建立胰腺癌模型，方法如下：對大鼠進行麻醉后固定，于腹部正中做10 mm小切口，顯露出胰腺組織，將胰腺被膜及胰腺實質切開1 mm，植入9 mg DMBA(批號H20180901)后縫合切口，消毒。30 d后大鼠皮下出現1 cm左右結節為胰腺癌建模成功。30只大鼠共建模成功24只，隨機分為模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組各8只。正常組、模型組大鼠予0.9%的氯化鈉溶液灌胃處理，低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠分別使用20、60 mg/kg半枝蓮提取物溶液灌胃處理，每組均連續干預14 d，1次/d。

1.2.3 標本的采集與處理：所有大鼠干預結束后，取尾部靜脈血2 ml，2000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80 ℃環境中保存待檢。采用斷頭法處死大鼠，分離胰腺組織，測量胰腺腫瘤組織體積、重量后將其固定于4%甲醛溶液24 h。

1.2.4 組織病理學檢測：將標本于甲醛溶液內固定后予常規石蠟包埋并切片，切片烤干后脫蠟，順序置入不同濃度梯度酒精中各復水3 min，蘇木精染色15 min后清洗3次，鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗后予1%伊紅染色，酒精脫水，脫蠟，封片后顯微鏡下觀察。

1.2.5 T淋巴細胞亞群檢測：待測標本予抗凝處理后分為兩管，分別加入20 μl的CD8+、CD4+、CD3+單克隆抗體，室溫環境下孵育30 min后在各管內加入融血劑，待其完全溶血后離心，3000 r/min，離心5 min，棄上清液，洗滌液洗滌后在各管內加入150 μl固定劑，加入0.5 ml的PBS混合均勻制備為懸液，采用流式細胞儀檢測CD8+、CD4+、CD3+水平。

1.2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡：細胞常溫下予20 μg/ml蛋白酶K培養0.5 h后去除蛋白，清洗后加入100 μl平衡緩沖液，室內平衡10 min，滴入100 μl的TdT酶反應液，避光、室溫孵育1 h后加入100 μl的SSC溶液，靜置20 min后清洗3次，DAPI復染，避光培養10 min后清洗、封片觀察。DAPI復染細胞核呈藍色，凋亡細胞細胞核呈綠色，取每切片3個視野進行觀察，計算細胞凋亡率。

1.2.7 蛋白印跡法檢測Wnt3α、β-catenin、PI3K、Akt、mTOR相對表達量：取Ripa裂解液，PMSF冰中孵育30 min，1500 r/min，離心15 min，取上清。每個樣品取15 g蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉入PDVF膜，5%脫脂牛奶常溫密封2 h，加入抗體過夜孵育，TBST液沖洗，加入二抗，60 min后清洗、顯色，計算Wnt3α、β-catenin、PI3K、Akt、mTOR相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠胰腺組織形態學比較 正常組大鼠胰腺組織細胞排列整齊，大小一致，界限清晰，細胞核均勻；模型組大鼠胰腺組織細胞細胞排列較為雜亂，且伴有嚴重炎癥細胞浸潤現象；高濃度半枝蓮組大鼠胰腺組織細胞排列較為整齊，大小相對一致，炎癥細胞浸潤現象明顯緩解(圖1)。

圖1 各組大鼠胰腺組織形態圖(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠腫瘤組織體積、重量比較 見表1。與模型組比較，低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠腫瘤組織體積小、重量均輕，差異有統計學意義(P<0.05)。與低濃度半枝蓮組比較，高濃度半枝蓮組大鼠腫瘤組織體積小、重量均輕，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠腫瘤組織體積、重量比較

2.3 各組大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平比較 見表2。與正常組大鼠比較，模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠CD8+水平較高，CD4+、CD3+水平較均低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠CD8+水平較低，CD4+、CD3+水平均較高，且高濃度半枝蓮組大鼠CD8+水平低于低濃度半枝蓮組，CD4+、CD3+水平均高于低濃度半枝蓮組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平比較(%)

2.4 各組大鼠腫瘤組織細胞凋亡率比較 低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠細胞凋亡率分別為(16.59±2.13)%、(25.71±2.96)%，均高于模型組(2.98±0.39)%的細胞凋亡率，差異有統計學意義(P<0.05)；且高濃度半枝蓮組大鼠細胞凋亡率高于低濃度半枝蓮組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 各組大鼠Wnt3α、β-catenin相對表達量比較 見表3。與正常組大鼠比較，模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠Wnt3α、β-catenin相對表達量均較高，且低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠Wnt3α、β-catenin相對表達量均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；與低濃度半枝蓮組比較，高濃度半枝蓮組大鼠Wnt3α、β-catenin相對表達量均較低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠Wnt3α、β-catenin相對表達量比較

2.6 各組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對表達量比較 見表4。與正常組比較，模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對表達量均較高，差異有統計學意義(P<0.05)；且低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對表達量均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；與低濃度半枝蓮組比較，高濃度半枝蓮組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對表達量均較低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對表達量比較

3 討 論

胰腺癌作為臨床上惡性程度極高的腫瘤，5年生存率低于5%，其發病原因及發病機制尚未闡明[10-11]。西醫抗腫瘤藥物具有較多的不良反應，中醫藥治療惡性腫瘤則具有細胞毒性小的優勢[12]。半枝蓮有悠久的藥用歷史，具有化瘀、解毒、清熱、調節免疫等功效。有研究表示，半枝蓮能夠誘導細胞凋亡、自噬，抑制細胞增殖、轉移，具有一定的抗腫瘤作用[13-14]。本研究顯示，半枝蓮提取物干預的胰腺癌大鼠腫瘤組織體積減小、重量減輕，且隨半枝蓮提取物濃度升高，腫瘤組織體積、重量下降幅度越大，說明半枝蓮提取對胰腺癌組織的生長具有一定的抑制作用，且呈濃度依賴性，其原因可能是半枝蓮提取物能夠有效促進胰腺癌大鼠癌細胞凋亡，抑制癌組織的生長。胰腺癌的發生發展與細胞增殖、凋亡關系密切，其可促進胰腺癌細胞凋亡，抑制胰腺癌細胞增殖，抑制進一步擴散[15-17]。本研究對胰腺癌大鼠癌細胞凋亡檢測結果顯示，半枝蓮提取物干預胰腺癌模型后，胰腺癌細胞凋亡率明顯上升。說明半枝蓮提取物具有促進胰腺癌組織細胞凋亡的作用，且呈濃度依賴性。

胰腺癌的發生發展與機體免疫功能水平密切相關，調節胰腺癌患者免疫功能是治療及改善其預后的關鍵[18]。T淋巴細胞亞群是評價機體細胞免疫功能的指標，本文研究結果顯示，與正常大鼠比較，胰腺癌模型大鼠T淋巴細胞亞群CD8+、CD4+、CD3+水平明顯異常，半枝蓮提取物干預的胰腺癌大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平明顯改善，且隨半枝蓮提取物濃度升高，CD8+、CD4+、CD3+水平改善更明顯，說明胰腺癌可導致機體免疫功能異常，半枝蓮提取物具有調節免疫的作用，且呈濃度依賴性。

Wnt/β-catenin通路參與癌細胞分化、自噬等生物學行為，Wnt3α、β-catenin是Wnt/β-catenin通路的主要配體，二者表達的變化與細胞自噬、凋亡密切相關[19-20]。本研究結果顯示，胰腺癌模型大鼠癌組織Wnt3α、β-catenin表達異常升高，半枝蓮提取干預后胰腺癌大鼠癌組織Wnt3α、β-catenin表達明顯下調，隨半枝蓮提取物濃度升高，Wnt3α、β-catenin表達下調更顯著，說明半枝蓮提取物干預胰腺癌模型大鼠，能夠通過Wnt/β-catenin通路調控胰腺癌細胞分化、自噬能力，從而抑制胰腺癌進展。PI3K-Akt信號通路相關蛋白P13K、Akt、mTOR表達變化與細胞凋亡能力密切相關，參與胰腺癌的發病[21-22]。本研究結果顯示，胰腺癌模型大鼠癌組織P13K、Akt、mTOR異常高表達，半枝蓮提取物干預的胰腺癌大鼠癌組織P13K、Akt、mTOR蛋白表達明顯下調，隨半枝蓮提取物濃度的升高，P13K、Akt、mTOR表達下調更顯著，說明半枝蓮提取物干預胰腺癌模型大鼠通過調控PI3K-Akt信號通路，促進胰腺癌細胞凋亡，抑制胰腺癌進展。

綜上所述，半枝蓮提取物可抑制胰腺癌模型大鼠腫瘤組織，調控胰腺癌大鼠T淋巴細胞亞群水平，調控Wnt/β-catenin通路及PI3K-Akt信號通路相關蛋白表達，促進胰腺癌細胞自噬、凋亡。